TAT-hEGF融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效自我表达

为了获得TAT-hEGF融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达,构建了原核表达载体pRSET-tat-hegf,将其转化E.coliBL21(DE3)得到重组工程菌BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf。工程菌在无IPTG的诱导下实现了高效表达,TAT-hEGF融合蛋白的表达量占总菌体蛋白的45.6%,主要以包涵体形式存在。

人胰岛素样生长因子Ⅰ型在E.coli和家蚕中的表达

将hIGF-I基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),在E.coli中进行了融合表达,West-ern blotting显示在26 kD附近有一条特异条带。将hIGF-I基因克隆进pBacPAK-8,获得了杆状病毒转移载体pBacPAK-8-IGF-I,在脂质体的介导下,与线性化的家蚕杆状病毒共转染家蚕培养细胞Bm-N,经空斑筛选,PCR检测,获得了重组病毒Bm-Bac-hIGF-Ⅰ。SDS-PAGE检测表明,在感染重组病毒后,家蚕幼虫血淋巴中可以检测到一条分子量约为7.5 kD的特异性条带,ELISA检测表达量达4.51μg/mL蚕血淋巴。

用重组大肠杆菌发酵生产人生长激素研究

通过不同培养基、不同糖浓度对重组菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ／ｐＩＮⅢＡ３ＨＧＨ的菌体生长与外源蛋白表达量的影响的比较，确定较为合适的培养条件，并对发酵过程中调节ｐＨ的氨水用量与外源蛋白的表达量之间的相关性作探索，得到相关性曲线，从而根据氨水用量了解细菌的生长状况。

重组人白细胞介素15工程菌高密度发酵条件探讨

目的研究表达重组人白细胞介素15(rhIL-15)工程菌高密度发酵的条件。方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白质表达的因素进行优化。结果以甘油为碳源可明显抑制有害物质乙酸的积累,提高工程菌的表达量和收获率。高密度发酵明显提高了目的蛋白质的表达量和工程菌的产量。结论该发酵工艺大大提高了rhIL-15工程菌的产量和表达水平,为rhIL-15的规模化生产打下了基础。

基因工程牛生长激素高密度发酵表达的研究

通过对重组牛生长激素基因工程大肠杆菌摇瓶和5、30 L发酵罐发酵表达的研究,建立了基因工程牛生长激素的高密度发酵表达工艺,菌体密度最高可达到OD550=120,rbIL-2的表达量占菌体总蛋白的20%以上。

重组人锰超氧化物歧化酶高密度发酵培养条件研究

目的:研究发酵罐中采用乳糖诱导高效表达重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的条件。方法:通过摇瓶和发酵罐培养研究了培养基、乳糖浓度、诱导时机、表达时间、溶氧条件、补料碳源种类对rhMn-SOD表达的影响。结果:乳糖诱导浓度为0.25%,溶氧浓度为40%～60%,用葡萄糖作为补料碳源进行高密度发酵,菌体密度A600达到28.98,菌体湿重达到60g/L,Mn-SOD活性达到18222.22U/g,比活为1057.5U/mg,实现了rhMn-SOD的高效表达。结论:对培养基配方和发酵条件进行了优化,为rhMn-SOD大规模生产奠定了基础。

羧基肽酶E(CPE)在人乳腺腺癌中的表达和功能(英文)

目的观察乳腺腺癌中羧基肽酶E(carboxypeptidase E,CPE)介导的神经内分泌肽加工和表达。方法使用RT-PCR、免疫组化、ELISA和Western blot等方法,比较CPE和生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone,GHRH)基因和蛋白质水平在42例乳腺癌和21例癌旁正常组织中的表达。结果乳腺癌组织中的CPE基因表达水平为1 024±237,而癌旁正常组织中CPE基因表达水平为805±83(P<0.01)。与乳腺癌旁正常组织比较,癌组织中CPE蛋白质显示了较高的表达(P<0.01)。乳腺癌组织中的GHRH基因表达水平为1 522±457,而癌旁正常组织中为1 067±437,差异有统计学意义(P<0.01)。与乳腺癌旁正常组织比较,癌组织中GHRH蛋白表达被上调(P<0.01)。结论癌组织中CPE和GHRH高表达提示癌细胞中存在较强的由CPE酶介导的神经内分肽转录后加工能力。

鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒的构建

生长激素（ＧＨ）是动物垂体前叶分泌的一种多肽类激素．应用分子重组及ＰＣＲ等技术，构建了一种鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒ｐＯｓＧＨ１５３，使编码鲑鱼生长激素成熟肽的序列克隆在大肠杆菌分泌型表达载体ＰＩＮ－Ⅲ－ｏｍｐＡ内，直接位于编码大肠杆菌外膜蛋白Ａ信号肽序列的下游，在Ｌｐｐ－Ｌａｃ杂合启动子控制下，经ＩＰＴＧ诱导，分子量约２３０００的鲑鱼生长激素在大肠杆菌中获得高效表达，该产物具有天然鲑鱼生长激素的免疫活性，直接分泌到细胞周质，而信号肽被自动剪除．

诱导重组人生长激素工程菌高效表达的研究

目的 筛选诱导重组人生长激素 (rhGH)工程菌高效表达的最佳条件 ,为中试及工业化发酵培养提供依据。方法 质粒PBV GH转化 4种不同宿主菌 ,比较 6种不同培养基在不同pH值、氧含量改变情况下 ,rhGH工程菌的生长和表达差异 ,筛选并确定最适宿主菌、最佳培养基及最佳诱导表达条件。结果 ①E coliDH5α为最适宿主菌 ;②TB培养基为最佳培养基 ;③培养基pH7 5～ 7 8有利于目的蛋白的表达。④在半对数生长期 (培养 4～ 5h)迅速升温 ,且菌密度控制在D6 0 0nm3 0之前诱导可获得较高的重组蛋白表达量 ,rhGH表达量占菌体总蛋白的 40 %。发酵时间为 1 0h。结论 E coliDH5α为rhGH高效表达的最适工程菌 ,E coliDH5α/PBV GH在pH7 5～ 7 8的TB培养基中发酵生长 1 0h,可使菌量最佳扩增 。

重组人生长激素对腹腔大肠埃希菌感染大鼠内毒素血症影响的实验研究

目的 观察重组人生长激素 (rh GH)对严重腹腔内大肠埃希菌感染大鼠内毒素血症的影响。方法 SD大鼠 75只 ,随机分为正常对照组、感染组和治疗组 (后两组又再分为 1d、3d两个亚组 ) ,每组 15只 ;感染组 :腹腔注射鸵鸟株大肠埃希菌标准菌株悬液 (1× 10 10 CFU/L ,15ml/kg) ;治疗组 :腹腔注射大肠埃希菌后给予rh GH(2 .2 5U·kg 1·d 1)肌内注射治疗 ;于注射后 2 4、72h分别测定各组大鼠的血浆内毒素含量、血浆TNFα浓度、白细胞总数和分类计数及平均动脉压 (MAP)。结果 感染组血浆内毒素含量显著升高 ,2 4h和 72h分别为 (0 .2 5 6±0 .0 5 2 )和 (0 .189± 0 .0 5 2 )EU/ml,明显高于对照组 [(0 .111± 0 .0 5 3)EU/ml,P <0 .0 1],血TNFα明显升高 [(3.5 9± 0 .6 9) / (2 .88± 0 .74 ) μg/L ,P <0 .0 5 ],呈现典型而严重的感染性休克临床经过 ,MAP显著降低 [(8.99± 3.0 1) / (16 .6 1± 1.85 )kPa,P <0 .0 1];治疗组血浆内毒素含量在感染后 2 4h轻度升高 [(0 .15 0± 0 .0 39)EU/ml],72h降至正常对照水平 [(0 .10 8± 0 .0 4 2 )EU/ml],与感染组比较 ,两个时点差异均有显著性 (P <0 .0 1) ,72h血TNFα浓度 [(1.5 4± 0 .36 ) μg/L]明显低于对照组 [(2 .88± 0 .74 ) μg/L ,P <0 .0 1]和感染组

利用重组大肠杆菌生产人生长激素发酵工艺的研究

在摇瓶培养和发酵罐培养条件下,研究了E.coli/BL21(DE3)/pET30a(+)-hGH工程菌的不同发酵工艺条件。确立了该工程菌的最优化工艺参数:M9-2培养基,37℃、pH值为6.8-7.4、诱导起始菌体密度为OD600达3.0-4.0,IPTG浓度为1mmol/L,诱导时溶氧控制为50%以上,补料为10%甘油、5%Yeast extract和5%Tryptone。该工艺条件经过连续三批发酵,证实稳定可行,目的蛋白在胞间质呈可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的20%以上。

rhGH在大肠杆菌周质中的分泌表达

在大肠杆菌周质中分泌表达rhGH既有利于消除其在临床应用上的抗原性又有利于提取纯化,在rhGH的发酵生产中越来越受到青睐。就rhGH在大肠杆菌中的分泌表达机制以及启动子、引导序列、宿主菌、培养基和培养条件对分泌表达效率的影响等方面进行了综述。

重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件。方法控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响。结果发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%-50%。补料前比生长速率为0.5-0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1-0.2/h。连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L（A=52.6）,质粒平均产量为359.8 mg/L。3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义。结论此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产。

大肠杆菌发酵重组人干扰素-α2a的高密度、高表达

利用NBS公司的BioFloⅢ发酵罐，采用培养基流加的方式培养表达人干扰素的E．coli工程菌，结果湿菌重达128g／L，干扰素活性达98×1010U／L发酵液。

重组人生长激素对大肠杆菌感染性休克及其预后影响的实验研究

目的 研究重组人生长激素 (rh -GH)对大肠杆菌感染性休克大鼠模型休克的临床过程及其预后的影响。方法 SD大鼠 75只 ,随机分为正常对照组、感染组和治疗组 (后两组又再分为 1d、3d两个亚组 ) ,每组 1 5只。感染组 :腹腔注射鸵鸟株大肠杆菌标准菌株悬液 (1× 1 0 1 0 cfu/L ,1 5mL/kg)制成感染性休克模型 ;治疗组 :腹腔注射大肠杆菌后给予rh -GH(2 2 5U·kg- 1 ·d- 1 )肌肉注射治疗。分别于注射后 2 4、72h测定血压、血浆TNF -α浓度、血常规等 ,测定结束后解剖观察大鼠肺、心、肾、肝、胃肠等脏器的病理改变。另有 39只大鼠随机分为正常对照组、感染组和rh -GH治疗组 ,每组 1 3只 ,处理同前 ,观察 2 4h存活率。结果 感染组大鼠呈现典型而严重的感染性休克临床经过 ,MAP显著降低 [(67 4± 2 2 6) / (1 2 4 6± 1 3 9)mmHg ,P<0 0 1 ] ,血TNF -α明显升高 [(3 59± 0 69) / (2 88± 0 74) μg/L ,P <0 0 5] ,肺组织广泛实变、出血及灶性坏死 ,2 4h存活率仅46 2 % (6/ 1 3) ;治疗组血压基本维持稳定 [(1 1 4 4± 1 5 9) / (1 2 4 6± 1 3 9)mmHg] ,72h时血TNF -α浓度 [(1 54± 0 36) μg/L]明显低于对照组 (P <0 0 1 )和感染组 (P <0 0 5) ,肺组织改变轻微 ,2 4h存活率 (1 1 / 1 3 。

E．coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E．coli中的分泌性表达

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点，在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点，组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体，使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达，另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。

重组人胰岛素样生长因子-1大肠杆菌高密度发酵研究

目的建立重组人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)在大肠杆菌高密度发酵中表达的工艺。方法以工程菌DH5α/pET32a(IGF-1)为对象,通过分批发酵培养优化溶解氧浓度、pH及温度等发酵条件,在此基础上以甘油为限制性基质进行分批补料发酵,考察不同补料方式对发酵的影响。结果适合重组hIGF-1在工程菌高密度发酵中表达的条件:在菌株活化与初始培养后,诱导时控制发酵系统溶解氧浓度为20%,温度为30℃,pH为7.2并以恒定pH反馈补料,发酵12h菌体密度OD600达44.53,得菌体干质量17.49g/L,平均生产强度为1.458g.L-1.h-1,其中重组hIGF-1的相对表达量为32.5%。结论研究为工业化生产hIGF-1奠定了基础。

重组人生长激素对腹腔大肠杆菌感染大鼠内毒素血症影响的实验研究

目的 :观察重组人生长激素 (rh -GH)对严重腹腔内大肠杆菌感染大鼠内毒素血症的影响。方法 :SD大鼠 75只 ,随机分为正常对照组、感染组和治疗组 (后两组又再分为 1天、 3天两个亚组 ) ,每组 15只。感染组 ;腹腔注射鸵鸟株大肠杆菌标准菌株悬液 (1× 10 10 cfu/L ,15ml/kg) ;治疗组 :腹腔注射大肠杆菌后给予rh -GH (2 2 5iu .kg-1.d-1)肌肉注射治疗。于注射后 2 4h、 72h分别测定各组大鼠的血浆内毒素含量、血浆TNFα浓度、白细胞总数和分类计数及平均动脉压 (MAP)。结果 :感染组血浆内毒素含量显著升高 ,2 4h和 72h分别为(0 2 5 6± 0 0 5 2 )和 (0 189± 0 0 5 2 )EU/ml,明显高于对照组 [(0 111± 0 0 5 3)EU/ml,P <0 0 1],血TNFα明显升高 [(3 5 9± 0 6 9) /(2 88± 0 74) μg/L ,P <0 0 5 ],呈现典型而严重的感染性休克临床经过 ,MAP显著降低[ (6 7 4± 2 2 6 ) / (12 4 6± 13 9)mmHg,P <0 0 1];治疗组血浆内毒素含量在感染后 2 4h轻度升高 [(0 15 0±0 0 39)EU/ml],72h降至正常对照水平 [(0 10 8± 0 0 42 )EU/ml],与感染组比较 ,两个时点均有显著差异 (P <0 0 1) ,72h血TNFα浓度 [(1 5 4± 0 36 ) μg/L]明显低于对照组 [(2 88± 0 74) μg/L ,P <0 0 1]和感染组[(2

重组人胰岛素样生长因子-1工程菌发酵培养基的优化

在摇瓶条件下,以M9培养基为基础,采用单因素实验和正交实验,对适合于表达重组人胰岛素样生长因子-1工程菌生长的高密度发酵培养基进行了优化。确定最佳培养基配方为:葡萄糖0.4%、甘油1.5%、酵母粉3%、胰蛋白胨3%、Na2HPO41.2%、KH2PO40.6%、NH4Cl 0.1%、NaCl 0.20%、MgSO40.048%,在此优化培养基中培养14h,工程菌菌体密度OD600达7.5。

重组人白细胞介素-6融合蛋白的大肠杆菌发酵工艺

研究了重组大肠杆菌表达人白细胞介素-6(rhIL-6)融合蛋白的发酵工艺。摇瓶实验对比了不同培养基对重组菌密度和rhIL-6表达量的影响,确定了以含0.1%葡萄糖的2×YT培养基为最适培养基。同时,还对诱导剂异丙基疏基半乳糖苷(IPTG)加入量进行优化,按每升发酵液加入0.02mmol,就能有效诱导rhIL-6的表达。在10 L发酵罐间歇实验中,以含0.1%葡萄糖的2×YT为培养基,比较了溶氧、pH、诱导前培养时间、诱导后培养时间对rhIL-6的表达量和菌密度的影响,得到最优培养条件为pH为6.8～7.0,接种量4%,温度37℃,诱导前溶氧量30%,在O.D._(600)为1.2～1.8时加入IPTG诱导,控制诱导后溶氧为5%～10%,再培养5 h,最终rhIL-6表达量为38%,菌体密度为5.8 g/L。