细菌的β-1,4一内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达

将大肠杆菌质粒pA2含气单孢菌（Aromonds.sp.212）的β-1，4-内切葡聚糖酶基因直接连干大肠杆菌／酵母菌穿梭载体pVC727组建成重组质粒，质粒PVC含强启动子。首先，通过菌落染色方法和Congo－Red染色方法筛选到大肠杆菌DH5α转化子，然后以重组质粒转化酿酒酵母BJ1991并得到表达。最后，对酶反应的最适pH和适宜温度进行了测定。

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4的构建

作者用ＤＮＡ重组技术，构建了大肠杆菌－枯草杆菌穿梭质粒载体ｐＳＵＧＶ４，它是以大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）质粒载体ｐＵＣ１８为骨架，与来自穿梭质粒表达载体ｐＲＥＰ９含有革兰氏阳性菌复制起点（ｏｒｉ＋）和卡那霉素抗性（ｋａｎｒ）基因片段重组而成．上述穿梭质粒载体可用于在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）和枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中进行基因克隆工作．

高产S-腺苷蛋氨酸合成酶基因工程菌的构建

应用PCR技术,以大肠杆菌BL21(DE3)染色体DNA为模板,扩增得到S-腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因。将所得基因连接至表达载体pET-22b(+),利用T7强启动子进行转录,然后转化进E.coli BL21(DE3)表达菌株,构建出了具有高效表达SAM合成酶基因的基因工程菌。重组菌所表达的酶活为115 U/g(以细胞干重计)。

Construction of Yeast Vectors with Resistance to Geneticin

Two Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae shuttle vectors containing a resistance marker to geneticin (G418) are constructed. Both vectors contain a kanamycin resistant marker (KanMX4) module coding aminoglycoside 3' phosphotransferase (APH) that renders E. coli resistant to kanamycin and S. cerevisiae to geneticin. These vectors overcome the shortage of the conventional yeast vectors bearing HIS3, TRP1, LEU2, and URA3 modules as selection markers, which require hosts to be auxotrophic. Green fluorescent protein (GFP) is used as the reporter to examine the functions of the vectors. The vectors are powerful tools for the convenient cloning and controlled expression of genes in most S. cerevisiae strains.

枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建

由枯草杆菌载体pUB110和大肠杆菌载体pGEM3构建了两个新的多功能穿梭载体pBE2和pBE3,它们具有强启动子和多酶切位点区。这两个载体能在枯草杆菌和大肠杆菌中复制和表达,是比较理想的载体。

高压脉冲电场处理时间对啤酒酵母 大肠杆菌和青霉的致死动力学研究

以啤酒酵母、大肠杆菌和青霉为研究对象,在一级动力学模型的基础上,研究处理时间对这3种微生物的致死动力学方程,并获得它们的临界处理时间tc和回归系数k2,从而证明三种菌对高压脉冲电场的耐受能力为:青霉>大肠杆菌>啤酒酵母。

以绿色荧光蛋白为报告基因的原核启动子检测体系构建

以质粒pMUTIN-GFP+扩增获得的gfp+基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBE2-GFP+。将组成型启动子P43和诱导型启动子Pspac克隆入pBE2-GFP+,得到重组表达载体pBE-GFP-P43和pBE-GFP-Pspac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。荧光显微镜检测GFP+蛋白的表达情况。结果表明,2种不同类型的启动子均能在大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌1A751中启动gfp+基因的表达。

一个从顶头孢霉中筛选具有启动子功能的DNA片段的简便方法

利用大肠杆菌-酵母穿梭质粒pGBT9构建了一个真菌启动子捕获载体pGBT14,用这个捕获载体构建了含顶头孢霉的0.5-2.0kb片段的染色体DNA文库,并从中筛选到顶头孢霉的24个DNA片段,这些片段能够在啤酒酵母中启动Trp1基因的表达。

以β-半乳糖苷酶为报告基因的原核启动子检测体系构建

目的:以β-半乳糖苷酶为报告基因构建原核启动子检测体系。方法:以由质粒pDL扩增获得的bgaB基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBEB。将组成型启动子P43和诱导型启动子Pspac克隆入pBEB,得到重组表达载体pBEBP43和pBEBPspac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。结果:两种不同类型的启动子均能在大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌1A751中启动bgaB基因的表达。结论:成功构建具有较为广泛适用性的原核启动子检测体系。

链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体的构建

本文报道了链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3的构建;把具有双启动子的大肠杆菌的质粒pGEM-3与新霉素抗性基因启动子缺失的链霉菌的探针质粒pIJ486分别用BamHI和BglⅡ酶切,T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli HB101(Amp(?),Neo(?)),所得重组质粒能强启动pIJ486质粒上的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph),并使新霉素抗性基因在大肠杆菌中得到强表达。此重组质粒被命名为pSE-3,当其转化到变青链霉菌TK54(Tsr(?),Neo(?))的原生质体前,新霉素抗性基因亦能得到强表达。酶切结果表明,构建的具有两个启动子的穿梭质粒载体pSE-3上有HindⅢ和EcoRI的单酶位点,拷贝数约为39。经再转化和传代50代等研究表明,穿梭质粒载体pSE-3在链霉菌和大肠杆菌中均是稳定的。为某些有应用价值的目的基因在大肠杆菌和链霉菌中的克隆与表达提供了一个有价值的穿梭质粒载体。

大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及应用

以大肠杆菌pMB1复制类型质粒pUC18为模板,PCR扩增了700bp的含质粒复制起始点和复制蛋白序列的DNA片段,克隆到质粒pBluskm的多克隆位点,得到含大肠杆菌质粒复制基因的中间载体pE3;以革兰氏阳性菌质粒pGDV1为模板,PCR扩增了含革兰氏阳性菌质粒正负链复制区域的2·5kb片段,并与pE3载体上的大肠杆菌复制子和复制蛋白连接构建了3·2kb的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103。电转化pGJ103质粒至枯草杆菌DB104和1A747,均能稳定地复制。以pGJ103为骨架,克隆了不同大小的生物素基因片段,均能正确稳定地复制,证明载体有良好的承载能力。将2kb的热稳定性β-半乳糖苷酶基因(bga)克隆至pGJ103构建了载体启动子检测载体pGJ199。用pGJ199质粒载体作为启动子检测载体,对革兰氏阳性菌启动子片段P59进行了转录活性检测。并以该载体为启动子探测工具,通过鸟枪法得到了大量启动子片段。

鲑鱼生长激素基因酵母分泌表达质粒构建

用ＰＣＲ方法改造鲑鱼生长激素（ＧＨ）ｃＤＮＡ，在成熟蛋白编码序列５′端前加入ＥｃｏＲⅠ位点，改造后的ｃＤＮＡ通过平端连接插入质粒ＹＥＰＭ０４，使鲑鱼ＧＨ基因置于酵母ＭＦα１因子分泌肽前导序列后、并在ＭＦα启动子调控之下，成为大肠杆菌酵母穿梭质粒ＹＥＰＭ０４ｆＧＨ．重组子酶切分析表明。

枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建

本文简要地报道了由枯草杆菌运载体pUB_(110)和大肠杆菌运载体pGEM_3构建的一个多功能穿梭载体pBE_2.该载体能在枯草杆菌和大肠杆菌中复制和表达,并具有一个强启动子和一个多酶切位点区可供广泛利用,是一个比较理想的运载体.