硝基苯并环磷酰胺化合物的还原及其细胞增殖抑制活性的研究

目的对以基因导向酶前药治疗策略为目的所合成的硝基环磷酰胺类化合物还原性及细胞增殖抑制作用进行研究。方法以NaBH4化学还原和E .coli硝基还原酶进行还原性研究;以E .coli硝基还原酶(T116 )和人醌氧化还原酶(NQO1F179)表达细胞(V79)进行细胞增殖抑制作用研究。结果以氧原子与硝基苯环相连的环磷酰6b和6d对E .coli硝基还原酶表达细胞增殖毒性的选择性在30倍以上。

重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题.考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响.结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行;底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都显著降低;高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用.

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以 E.coli MC41 0 0染色体 DNA为模板使用 PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因gua C,该基因全长 1 0 44bp,编码相对分子质量为 3 7ku的蛋白质。将该基因直接克隆于 p ET-1 6b质粒的 T7启动子下游 ,得到质粒 p EXP1。转化 E.coli BL2 1 (DE3 ) ,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导 ,获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明 ,鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的 80～