鱼类致病性迟钝爱德华氏菌胶体金快速检测试纸的研制

制备迟钝爱德华氏菌胶体金快速检测试纸并对其性能进行检测。以柠檬酸三钠作为还原剂制备胶体金颗粒,标记迟钝爱德华氏菌多克隆抗体,将羊抗兔IgG和纯化后的迟钝爱德华氏菌多克隆抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,以检测样品中的迟钝爱德华氏菌（E.tarda）。结果表明：所研制的试纸特异性良好,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌等常见细菌或病原菌进行测试未出现交叉反应;敏感度达到105CFU/mL,反应时间仅为5~10 min,可以用于感染迟钝爱德华氏菌大菱鲆腹水的现场检测,具有操作简便、特异性强、灵敏度高等特点。

eha基因调控迟缓爱德华菌抵抗巨噬细胞氧化杀菌作用

目的迟缓爱德华菌(E.tarda)能够在巨噬细胞内生存和繁殖,必须抵抗细胞产生活性氧的杀菌作用。eha基因是该菌一个重要的转录调控基因,本研究探讨eha基因调控E.tarda抵抗巨噬细胞氧化杀菌的机制。方法光镜观察野生株和缺失株分别感染RAW264.7巨噬细胞的过程,及菌落计数法测定细菌胞内存活数目;测定细菌在不同H2O2浓度中的存活率;流式法检测细菌感染巨噬细胞后产生活性氧的细胞比率;qRT-PCR测定细菌超氧化物歧化酶基因sodC和过氧化氢酶基因katB的转录水平。结果 eha基因的缺失,使E.tarda在巨噬细胞内的繁殖速率明显下降(P<0.05),使该菌在不同H2O2浓度中的存活率显著降低(P<0.05),使该菌感染细胞组产生活性氧的细胞比率升高;qRT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得该菌的超氧化物歧化酶基因sodC和过氧化氢酶基因katB转录水平下降。结论 eha基因通过调控E.tarda菌分解H2O2相关基因的表达,从而影响该菌分解巨噬细胞中活性氧的能力和在胞内外的存活率。因此,eha基因调控了E.tarda菌抵抗巨噬细胞内氧化杀菌作用,有助于该菌在巨噬细胞内生存和繁殖。

基于RNA-seq分析Eha调控迟缓爱德华菌抵抗酸化的作用

目的 Eha是一个影响迟缓爱德华菌(Et)胞内生存的转录调控因子,本研究有助于揭示其调控Et抵御酸的分子机制。方法用ATPase抑制剂洛霉素A1抑制巨噬细胞的酸化,菌落计数法比较酸化对野生株和eha基因缺失株胞内存活数目的影响;比较两种细菌在酸性应激实验中存活率的差异;构建pMP220-P_(eha)LacZ质粒,采用β-半乳糖苷酶实验检测eha基因的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性;选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间,分别提取两种细菌RNA,进行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR验证其结果。结果野生株ET13在巨噬细胞内和不同pH酸环境中的存活率明显高于缺失株,阻止酸化胞内菌数明显高于未阻止酸化的胞内菌数(P<0.05)。对数期细菌pH6.3培养基生长2h,RNA-Sequencing结果表明:eha基因缺失株转录水平和野生株相比,147个差异显著表达的基因(DEGs)(|log2Ratio|≥1),其中113个上调,34个基因下调,qRT-PCR随机抽样,和RNA-Sequencing表达趋势呈强相关。147个基因采用GO数据库进行功能聚类,分成25类,主要涉及细菌加工、定位、代谢、结合、催化、运输、细胞成份;基于KEGG通路的富集分析,有130个可以富集到55条通路中,包括与氨基酸、核苷酸、脂质代谢及铁的转运等路径,涉及基因较多的有双组分系统、ABC转运系统、不同环境中的微生物代谢和次级代谢产物等路径。结论在酸性生存环境,Eha对Et的转录组呈多途径、多基因的适应性的全局性调控。

eha基因调控迟缓爱德华菌的毒力

目的 eha基因是E.tarda毒力株ET-13一个重要的转录调控基因,本文研究其对该菌株毒力的影响。方法利用菌落计数法比较野生株和eha缺失株感染小鼠毒力(LD50)的差异,以及比较两菌株在小鼠每个肝脏、脾脏和肾脏中细菌菌落数目的差异;利用组织HE染色观察两菌株对宿主组织损伤的差异;利用RT-PCR,比较两种细菌毒力基因表达的差异。结果 eha缺失株相比野生株其毒力下降了2.5倍;eha缺失株在宿主体内的生存能力明显降低。小鼠感染野生株后,出现肝细胞水肿和中性粒细胞浸润,脾小体内细胞坏死,肾小管水肿等病变,以及上述脏器外观出现改变。提示野生株对小鼠的肝脏、脾脏和肾脏有毒性作用,而eha缺失株对上述脏器无明显毒性作用。RT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得E.tarda菌的Ⅲ型分泌系统分泌蛋白基因eseC和外膜蛋白基因(pagC)的转录水平下降,菌毛蛋白基因(fimA)的转录水平没有改变。结论 eha基因缺失后,E.tarda菌ET-13株的毒力因子表达降低,使该菌毒力明显减弱,对宿主的致病性和病理损伤减轻。因此,eha基因是一个毒力正调控基因。

牙鲆迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株感染症及其病原特性研究

目的 分离鉴定了牙鲆 (Flounder ,ParalichthysolivaceusL .)病原迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株 (E .tardain dole negative)并对其特性进行了研究。 方法 对牙鲆迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiellatarda)感染病例进行了自然病例检验 ,病原细菌的分离与鉴定、血清型检定、致病力检验、荧光抗体检验及药物敏感性测定。结果 通过对牙鲆迟钝爱德华氏菌感染病例发病情况、临床特征、病理变化等方面的检验及细菌的分离与鉴定 ,表明所检病例为迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株感染。对分离后做纯培养的 2 0株菌进行了主要生物学性状及血清型的测定 ,表明 2 0株分离菌对所测各项特征的结果一致 ,且均为同种血清型。分离代表菌株做对健康牙鲆鱼的人工感染试验表明了相应的原发病原学意义及较强的致病作用。药敏试验结果表明 ,对供试 37种抗菌药物中的头孢唑啉等 2 2种药物敏感、对青霉素G等 7种药物耐药、对氨苄青霉素等 8种药物表现了株间差异。以荧光抗体技术对纯培养物、人工感染病死鱼肝脏中细菌的检验 ,均呈现了特异荧光反应。结论 从牙鲆病例分离鉴定了迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株 ,研究报告了其主要生物学特性 ,为对由此类病原菌引起的牙鲆感染症的有效检验与防治及进一步研究等奠定了基础。

eha,迟缓爱德华菌一个毒力调控基因

目的探讨迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)溶血相关基因(E.tardahaemolysin activator gene,eha)基因调控该菌毒力基因的作用。方法利用自杀质粒pHM5,缺失E.tarda的eha基因,得到△eha缺失菌株,再构建△eha株的互补菌株。通过平板溶血性法、接触溶血法、上清溶血法,观察野生株、△eha缺失株与及互补株溶血性的差异。利用MTT法比较三种细菌培养物的过滤液对Vero细胞的毒性的差别。利用H2O2抗性纸片扩散法,比较三种菌对过氧化氢抵抗力的差异。利用RT-PCR和SDD-PAGE电泳超速酸化离心法提取的鞭毛蛋白,比较三种细菌鞭毛基因的转录和表达的差异。结果△eha缺失株和互补株不溶血,而野生株溶血。eha基因的缺失降低E.tarda菌对过氧化氢的抵抗力,△eha缺失株较野生株的细胞毒性明显减弱,eha基因可以调控迟缓爱德菌鞭毛基因的转录和表达。结论 eha基因可以调控迟缓爱德华菌毒力基因的表达,是一个毒力调控基因。

大鲵源迟缓爱德华菌的生物学特性及其感染的病理损伤

【目的】研究引起两养殖场大鲵(Andrias davidianus)以肠炎、腹水为临床特征疫情的病原特性及其病理损伤特点。【方法】对患病大鲵进行细菌分离、形态学观察、生理生化测定、16S rDNA序列分析及毒力相关基因检测,并通过K-B法进行药敏试验和HE染色进行组织病理学观察。【结果】分别从患病大鲵的肝、肾和腹水中分离到两株优势菌(XY01,XY02),鉴定为迟缓爱德华菌(Edwards tarda),其携带citC、fimA、gadB、katB、mukF与esrB 6种毒力基因,对阿莫西林、万古霉素及卡那霉素等耐药,对氟苯尼考、庆大霉素和多黏菌素-B等敏感。组织病理学上,感染大鲵表现为多组织器官损伤和全身性炎症反应,尤其以肝、脾、肾和肠的病理损伤较为明显,表现为细胞变性、坏死,大量淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞浸润。【结论】明确了引起两养殖场疫情病原迟缓爱德华菌的生物学特性及其感染的病理学特点,为大鲵迟缓爱德华菌感染的诊断与防治提供了参考。

迟钝爱德华菌PuAH基因的原核表达及其部分特性分析

本试验旨在对迟钝爱德华菌EIB202 PuAH基因进行克隆表达,并对其部分特性进行分析。根据GenBank中发表的迟钝爱德华菌PuAH基因序列(登录号:CP001135,CDS编号:ETAE_0818)设计引物,克隆并通过表达载体pET32a重组表达该基因所编码的蛋白,纯化表达产物并制备兔抗血清,采用ELISA、Western blotting、溶血试验、菌体凝集试验分析所得融合蛋白的特性。结果显示,所得融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达,蛋白分子质量约为42ku;具有免疫原性和抗原性,对鳗鲡红细胞不具溶血性,但融合蛋白抗血清对迟钝爱德华菌EIB202膜蛋白提取物的溶血性有一定的抑制作用,且可以凝集迟钝爱德华菌EIB202菌体。

生物免疫传感器检测迟缓爱德华氏菌研究

迟缓爱德华氏菌(E.tarda)是最为严重的水产动物致病菌之一,准确、即时的检测手段是预防控制该菌传播的关键所在。通过量子点(QDs)标记E.tarda单克隆抗体(Ab),利用生物免疫传感器技术实现E.tarda的快速、特异性检测。结果显示,QDs-Ab的荧光通过加入氧化石墨烯(GO)产生淬灭,构建了捕获目标细菌的探针,GO最适淬灭浓度为60μg/L。细菌捕获探针中加入E.tarda后,能够检测到重新恢复强度的橙色荧光。针对E.tarda设计的生物免疫传感器的特异性,选取灿烂弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌作为对照,结果显示,对照组不能明显引起荧光强度的改变,而实验组却能显著提高荧光强度。本研究建立的基于荧光能量共振转移(FRET)的具有高灵敏度和特异性的生物传感器检测方法在细菌的早期诊断中有良好的应用潜质。

脑脊液中检出一株迟钝爱德华菌

从1例高血压脑出血破入脑室并脑疝患者的脑脊液分离出一株迟钝爱德华菌,临床较为少见。该病例为医院内感染病例。

迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC原核表达及其免疫原性

TolC是革兰阴性细菌一种外膜通道蛋白,参与细菌应对外界不利环境的耐受,沙门菌TolC蛋白作为免疫原对动物沙门菌感染的保护效果优良,具有潜在的应用价值。目前,迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)该蛋白的研究尚未见有报道,本研究以E.tarda TolC蛋白作为研究对象,原核表达并纯化TolC蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白具有较强的免疫原性,免疫动物对致病性E.tarda ET-13强毒株感染具有较高的抵抗力。结果表明,E.tarda TolC蛋白具有较强的免疫原性和潜在的疫苗价值,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供理论资料。