猪瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的协同免疫保护作用

为了研究杆状病毒表达的糖基化亚单位疫苗的协同免疫保护作用,将重组杆状病毒感染Sf9细胞制备猪瘟E2、E0重组蛋白,Western blot检测蛋白表达和糖基化情况。用重组蛋白单独或联合免疫家兔,检测血清中抗体水平变化。在首免后4周用猪瘟兔化弱毒疫苗C株攻毒家兔,监测其体温变化,并运用RT-PCR检测家兔脾脏中病毒RNA。结果表明,E2、E2+E0免疫组兔均可诱导产生高水平的抗体和中和抗体,但两组间差异不显著。攻毒后E2免疫组2/5兔出现轻热症状,1/5兔脾脏病毒阳性;E2+E0组兔均未出现发热症状,也未检测到C株病毒RNA。E0组不能诱导兔产生中和抗体,但也能提供部分保护(2/5)。可见,基于E2、E0的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,且两者联合使用具有协同作用,有望成为新型亚单位疫苗的候选抗原。

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪瘟病毒(CSFV)E0重组蛋白,建立CSFV抗体快速检测方法。本研究通过扩增CSFV C株E0基因,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-2-E0,转化至宿主菌Rostta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE检测表明与目的蛋白大小一致,其分子质量大小为46ku。优化重组蛋白表达条件,最终获得诱导表达的最佳温度为37℃,最佳IPTG浓度为0.1mmol/L,并且目的蛋白以包涵体形式存在。Western blot表明,目的蛋白能与CSFV兔化高免血清反应,表明该融合蛋白具有良好的抗原性。本研究为CSFV抗体检测试剂盒的研究奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能够引起牛羊的持续感染,临床上很难对其根除,建立该病有效检测方法对净化畜群具有重要意义。本研究构建BVDV E0蛋白基因重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达,用重组的E0蛋白为包被抗原,确定抗原最佳包被浓度为5μg/mL,最佳血清稀释比为1∶10,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,酶标二抗稀释度为1∶5000,作用时间为30 min,样品临界值X+2S为0.278。该方法与IDEXX的BVDV间接ELISA试剂盒比较总符合率为86%,与口蹄疫病毒、牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副结核、牛布鲁氏菌病阳性血清无交叉反应。该检测方法能够用于BVDV抗体水平的临床检测,可为感染病畜的合理淘汰提供实验依据。

构建表达猪瘟病毒E0基因的重组杆状病毒

为了得到可溶性重组猪瘟病毒E0蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况，将增强型水母绿色荧光蛋白基因（EGFP）与E0基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中，与线性杆状病毒DNA共转染Sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒，将其感染Sf9细胞制备P1种子液，同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染Sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定，确定P2种子液的病毒滴度达1．14×10^7pfu／mL。将P2种子液以MOI5～10接种指数期SD细胞．3d后呈现出最强的荧光。重组杆状病毒在Sf9细胞中的初步成功表达为进一步制各重组E0糖蛋白．研究E0蛋白的结构与功能、免疫诊断新方法和猪瘟基因工程疫苗奠定基础。

猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定

[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。

分泌表达牛病毒性腹泻病毒E0蛋白MDBK细胞的稳定性分析

目的:构建分泌表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白的MDBK细胞系,并探究其传代和冻存稳定性。方法:用实验室制备的BVDV E0基因重组慢病毒感染MDBK细胞,荧光观察并收集MDBK细胞培养上清进行Western印迹分析,通过qPCR方法检测重组细胞系中重组基因拷贝数变化。结果:IgK信号肽组和预测信号肽组均分泌表达E0蛋白;通过Oligo6.0软件设计BVDV E0基因SYBR GreenⅠ染料法荧光定量PCR检测引物,经过条件优化,未出现非特异性扩增,检测下线为20拷贝/μL;通过建立的荧光定量PCR和流式分析对2组细胞系进行传代稳定性分析,结果2组细胞系在第12代之后荧光率显著下降,15代之后E0基因拷贝数显著下降,2组细胞冻存前后荧光率未发现显著变化。结论:构建了稳定分泌表达BVDV E0蛋白的MDBK细胞系,建立了BVDV E0基因定量检测方法,为研究E0蛋白的生物学功能、探索BVDV的防控措施以及开发基因工程诊断抗原和基因工程亚单位疫苗奠定了基础。

猪瘟病毒结构蛋白E0抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

为建立一种经济、可靠的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,采用间接ELISA(E0-ELISA)方法,以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组蛋白E0为包被原,优化反应条件。结果显示,优化后的E0-ELISA在包被原1.0μg/mL质量浓度下37℃包被1 h效果最佳,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉溶液37℃作用2 h,待检血清以1∶100稀释后37℃作用60 min效果最佳,二抗以1∶5000稀释后37℃孵育45 min效果最佳。当OD 450<0.370时,判断为猪血清CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为1.99%~7.69%和2.16%~9.23%,表明该方法具有良好的稳定性;E0-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清时结果均为阴性;当CSFV阳性血清稀释至1∶640时结果仍为阳性,表明该检测方法具有良好的敏感性;与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比,E0-ELISA检测符合率为92.00%,敏感性为97.86%,特异性为78.33%。综上,成功建立一种经济、稳定、特异性好和敏感性高的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法。

重组腺病毒介导的猪瘟E0基因在山羊乳腺中的表达

为使猪温病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌,一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFVE0基因通过腺病毒穿梭载体被插入到腺病毒质粒中,将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0。为证明其有效性,用Ad-hisE0感染293A细胞,实时定量PCR检测显示E0基因的表达显著提高。用Ad-hisE0分别感染牛乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺,SDS-PAGE和Western blot分析结果显示出E0蛋白分别位于26ku和48ku处的2条特异性条带。证实构建的腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。

表达猪瘟病毒E0-E2蛋白的重组腺病毒疫苗免疫效力研究

为研究重组猪瘟腺病毒活载体疫苗(rAd-E0-E2株)对猪的免疫保护效力,并确定其最小免疫剂量及免疫期,本研究将40头健康仔猪随机分为8组,每组5头,1~5组为最小免疫剂量测试组,分别接种rAd-E0-E2株活疫苗1/20头份、1/10头份、1/2头份、1头份(1.58×107.0IFU),另设生理盐水对照组。于免疫后7 d、14 d收集血清,采用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体,免疫后14 d攻毒;6~8组为免疫期组,分别接种1头份的rAd-E0-E2株活疫苗和1头份的猪瘟活疫苗(脾淋源,C株),于免疫后7 d、14 d、21 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d、210 d收集血清,采用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体,免疫后7个月攻毒。所有试验组猪攻毒后监测体温变化,观察猪瘟临床症状和剖检病变。最小免疫剂量检测结果显示,1/20头份剂量组攻毒后1/5保护,4/5出现高热稽留、典型CSF症状和剖检病变;1/10头份、1/2头份和1头份剂量组攻毒后均5/5保护,体温无明显变化,无猪瘟临床症状和剖检病变。免疫期结果显示,免疫组攻毒后均为5/5保护,且r Ad-E0-E2株免疫后7个月抗体水平高于C株,阴性对照组猪攻毒后均发病。综上所述,疫苗的最小免疫剂量为1/10头份(1.58×106.0IFU),考虑到临床实际应用影响因素较多,为确保免疫效果,将疫苗的使用剂量定为最小免疫剂量的10倍,即1头份。r Ad-E0-E2株活疫苗免疫猪1头份后免疫期至少为7个月。本研究为r Ad-E0-E2株后续应用提供了参考依据。

表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK-15细胞系构建

将克隆到pGEM T-easy载体中的E0基因双酶切回收后,连接到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)中,利用Lipofectami-neTM2000将重组子转染PK-15、BHK-21、VERO 3种细胞,直接在荧光显微镜下用蓝光激发进行观察,在3种细胞中都可以观察到绿色荧光,而且在转染后的24、48、72 h 3个时间点上,观察到的荧光细胞数量逐渐增多,在72 h时荧光细胞的数量在3种细胞中都达到最多,总的来看,在PK-15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现,重组质粒的荧光主要分布在胞浆内,而且细胞核周围的荧光较强,胞核与胞浆的界限明显,尤其是在PK-15细胞和VERO细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP-N1 Vector转染3种细胞后,都可以观察到绿色荧光,但是整个细胞中是均匀出现荧光的。经酶切、PCR、单抗间接免疫荧光检测,PK-E0细胞中有大量的HCLV的E0表达,单纯的PK-15细胞中没有E0的表达。HCLV株在PK-E0细胞中从48h开始到72h的滴度比在PK-15细胞中的滴度要高。证明PK-E0细胞中E0蛋白的大量表达增加了HCLV在细胞中的复制。

动物蛋白胶对绿色地板基材性能的影响

根据动物蛋白胶改性剂的特性,利用北华大学实验室实验的结果,在延边长白山林业集团汪清林源木业有限公司连续平压高密度纤维板生产线上,进行了动物蛋白胶作为脲醛树脂胶黏剂的改性剂生产E0级地板基材的中试实验。结果表明:动物蛋白胶改性剂的添加,不但提高了地板基材的力学性能,还在降低甲醛释放量上具有显著的效果,可生产E0级地板基材;在提高地板基材的力学性能指标方面,粉状动物蛋白胶改性剂比膏状动物蛋白胶改性剂的效果更好;粉状改性剂添加量为12%时,高密度纤维板力学性能最好。

猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E0和E2蛋白,并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性,为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段,运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体,构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清,通过间接ELISA方法测定抗体水平,间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示,37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下,E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达,经纯化复性后免疫小鼠,制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白,制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。

牛病毒性腹泻病毒E0和E2蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠埃希菌中融合表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0和E2基因,并进行纯化。方法采用RT-PCR法分别扩增BVDV BA株的E0和E2基因片段,通过酶切位点将二者串联并克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-E0-E2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白E0-E2经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot分析。结果重组表达质粒pET-28a-E0-E2经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白E0-E2相对分子质量约为68 500,表达量约占菌体总蛋白的20%,主要以包涵体形式存在;纯化的融合蛋白纯度达95%,可与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应。结论在大肠埃希菌中融合表达了BVDV E0和E2蛋白,纯化后的融合蛋白纯度较高,为BVDV抗体ELISA检测方法的建立及新型疫苗的研制奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的表达与多克隆抗体制备

为了制备BVDV的E0蛋白兔源多克隆抗体,试验采用大肠杆菌对E0蛋白进行了表达,根据已发表的BVDV的VEDEVAC株的全基因组序列设计1对扩增E0的引物,经RT-PCR扩增出长约680 bp的E0基因片段,然后将目的基因克隆到pET-30a载体上,经酶切鉴定获得阳性重组质粒后进行测序,再将测序正确的阳性重组质粒转化BL21表达菌,经扩大培养及IPTG诱导后获得以包涵体形式存在的重组E0蛋白,经亲和层析法纯化后进行Western-blot检测,同时以纯化的E0蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并对E0多克隆抗体进行了中和试验和免疫荧光检测。结果表明:E0蛋白具有良好的反应性;E0多克隆抗体的病毒中和试验测定其中和抗体效价达到1∶128,具有良好的反应性和特异性。说明制备的重组E0蛋白多克隆抗体可以用于BVDV的检测。

TALEN介导猪瘟病毒结构蛋白基因E0敲入山羊乳腺上皮细胞β-乳球蛋白基因座

验证整合于山羊β-乳球蛋白基因座的猪瘟病毒E0(CSFV E0)基因是否能够利用内源性启动子调控该基因表达,为制备转CSFV E0基因山羊做好准备。利用脂质体转染的方法将实验室已构好的针对山羊β-乳球蛋白基因第一外显子的TALENs表达载体和包含CSFV E0基因的打靶载体共转染山羊乳腺上皮细胞,用药物(G418)进行筛选获得单克隆,并对获得的克隆进行5′端和3′端鉴定,鉴定都为阳性的克隆进行激素诱导24h后,收集培养液和细胞。通过RT-PCR和Western blot技术检测证明,转基因阳性细胞能够表达并分泌出CSFV E0蛋白。本试验为以转CSFV E0基因细胞为供核体进行核移植制作转基因动物奠定了基础。

热休克蛋白70促进猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的小鼠免疫效果

为了初步探索热休克蛋白70(Hsp70)作为分子佐剂增强猪瘟病毒亚单位疫苗的免疫效果,本研究根据猪瘟病毒兔化弱毒株囊膜糖蛋白E0的基因序列,设计一对特异性引物,RT-PCR扩增得到完整的E0基因,将其分别插入到原核表达质粒pColdI和含有副猪嗜血杆菌Hsp70的pColdI-Hsp70中,构建了pColdI-E0和pColdI-E0-Hsp70重组质粒,经IPTG诱导表达后,获得了E0、Hsp70和E0-Hsp70融合蛋白。将以上三种蛋白纯化后分组免疫Balb/c小鼠,通过ELISA和流式细胞术测定了小鼠针对E0蛋白的体液免疫和细胞免疫效果。结果显示:E0-Hsp70融合蛋白和E0+Hsp70混合物免疫后均能显著提高抗E0的抗体效价、CD4+和CD8+T细胞水平,并促进IFN-γ的释放。研究结果表明Hsp70能显著增强猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0在小鼠上的免疫效果,为在猪体上的进一步应用奠定了基础。

检测猪瘟病毒E0抗体ELISA方法的建立与应用

E0蛋白是猪瘟病毒(CSFV)重要的结构蛋白之一,能刺激机体产生中和性保护抗体,同时也是作为鉴别诊断的标识之一。本研究通过RT-PCR扩增得到石门株E0基因,构建了重组质粒pET-28a-E0,原核表达E0目的蛋白后鉴定了其免疫反应性。将纯化后的目的蛋白进行梯度稀释,建立了ELISA检测方法,优化反应条件如下:最佳蛋白包被浓度2μg/mL,最佳一抗和二抗的稀释倍数分别为1∶100及1∶40 000,一抗孵育时间为30 min,阴阳性临界值分别为0.293和0.418。结果显示组间与组内变异系数均小于10%,无交叉反应性,特异性良好。用建立的方法与商品化试剂盒同时检测206份临床免疫疫苗的血清样本,阳性和阴性及总体符合率分别为96.55%、84.21%及94.17%,表明ELISA方法具有良好的敏感性、稳定性和符合率,可用于临床样本的检测。用该方法检测了85份免疫了E2亚单位疫苗的临床猪血清样本,阳性率为10.59%,表明该方法可初步用于临床CSFV抗体的快速检测及鉴别诊断。

不同信号肽对猪瘟E0蛋白在HEK-293F细胞中分泌表达的影响及E0-ELISA方法的建立

为建立以猪瘟病毒(CSFV)E0蛋白为包被抗原的间接ELISA方法,构建含5种常用信号肽及其内源信号肽的CSFV E0重组表达质粒,瞬时转染至HEK-293F细胞中表达。Western-blot结果显示,不同信号肽介导的E0蛋白在细胞中均能分泌表达,其中人胰岛素(Insulin)信号肽介导的E0蛋白分泌表达水平最高。将其纯化后的E0蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,并与IDEXX ELISA试剂盒平行检测173份血清,结果显示E0-ELISA与IDEXX ELISA符合率为92.49%。将两者分别与病毒中和试验(VNT)对比,结果显示E0-ELISA与VNT符合率为95.38%,IDEXX ELISA与VNT符合率为91.33%,说明E0-ELISA比IDEXX ELISA更敏感。本研究通过使用不同信号肽使猪瘟E0蛋白在HEK-293F中高效糖基化表达,以该E0蛋白作为包被抗原建立了E0-ELISA方法,为临床鉴别猪瘟野毒感染提供了技术手段。

黑龙江省部分地区进口荷斯坦奶牛病毒性腹泻血清流行病学调查

为了解黑龙江省进口荷斯坦奶牛感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的情况,试验采用原核表达蛋白E0-E2为抗原,建立间接ELISA法,检测奶牛血清中BVDV的抗体。结果表明:九三地区的BVDV抗体阳性率最高,达到了72.22%;密山地区阳性率最低,但也达到了59.91%;北安地区阳性率为61.84%,总体血清阳性率为64.35%。说明病毒性腹泻在黑龙江省存在非常高的血清阳性率,提示必须加强对本病的检疫净化,采用间接ELISA法对不同牛群进行BVDV抗体检测,可以及时了解病毒性腹泻的感染清况,为防治该病提供理论依据。