利用酵母双杂交技术筛选和鉴定非洲猪瘟病毒E120R蛋白的互作宿主蛋白

【目的】探讨非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)衣壳蛋白E120R在病毒感染中的作用,确定与E120R蛋白互作的宿主蛋白。【方法】将ASFV分离株CADC_HN09株E 120 R基因合成并克隆于pGBKT7表达载体,获得pGBKT7-E120R诱饵质粒,同时构建E 120 R基因截短表达质粒pGBKT7-E120R-1(1-61位氨基酸)和pGBKT7-E120R-2(62-122位氨基酸)。经毒性和自激活性检测后,通过酵母双杂交技术对骨髓巨噬细胞(BMDMs)cDNA均一化酵母文库进行初步筛选,以获得与ASFV E120R蛋白互作的蛋白。通过NCBI数据库进行序列比对并经免疫共沉淀试验验证,确定互作的宿主蛋白。筛选的宿主蛋白经webgenstal在线分析网站初步进行GO功能和KEGG通路富集分析,以确定所筛选的宿主蛋白参与的生物过程与信号通路。【结果】诱饵质粒pGBKT7-E120R-2无毒性和自激活性,可用于文库筛选。通过酵母双杂交系统从BMDMs cDNA均一化酵母文库中初步筛选到46个阳性克隆并进行回转验证,经NCBI数据库序列比对分析共获得29个宿主蛋白。免疫共沉淀试验结果显示,多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)和干扰素刺激基因15(ISG15)均与E120R蛋白存在互作。GO功能富集分析表明,所筛选的宿主蛋白可参与代谢过程、生物调节、应激反应等生物过程;KEGG通路富集分析表明,这些宿主蛋白可参与抗原呈递、铁死亡和坏死性凋亡等多条信号通路。【结论】ASFV E120R蛋白可与宿主免疫应答、细胞死亡等信号通路相关的多种宿主蛋白互作,为进一步研究ASFV E120R蛋白在病毒感染过程中的作用提供了重要理论依据。