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非洲猪瘟病毒C129R蛋白与E165R蛋白的可溶性表达、胞外酶活力测定与结构预测分析
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作者 王彦伟 岳亚男 +5 位作者 张素玲 李欢欢 陈赵媛 刘月月 逄文强 田克恭 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第7期52-57,共6页
C129R和E165R分别是非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组编码的一种Mn依赖的超氧化物歧化酶和尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶,2种酶均参与ASFV的复制过程。通过研究ASFV C129R蛋白与E165R蛋白的功能,以指导非洲猪瘟的诊断及免疫预防研究。对ASFV SY-1... C129R和E165R分别是非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组编码的一种Mn依赖的超氧化物歧化酶和尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶,2种酶均参与ASFV的复制过程。通过研究ASFV C129R蛋白与E165R蛋白的功能,以指导非洲猪瘟的诊断及免疫预防研究。对ASFV SY-18株的C129R和E165R基因序列进行密码子优化后,利用大肠杆菌进行表达,纯化后获得重组蛋白,通过Western blot鉴定其反应性,并对其胞外酶活力进行测定,对C129R蛋白的结构预测结果进行分析。结果:实现了C129R蛋白与E165R蛋白的可溶性表达,重组蛋白分子量分别约为15 kDa和18 kDa, Western blot显示C129R与E165R蛋白均能与ASFV阳性血清产生特异性反应;胞外酶活力测定显示,C129R与E165R蛋白在胞外均有酶学活性,比酶活力分别为(60.2±3.8) U/mg和(32.6±2.4) U/mg;蛋白质结构预测结果显示,C129R为双结构域蛋白,主要由N端α螺旋结构域和C末端α/β结构域组成,C129R蛋白N端α螺旋结构域和C末端α/β结构域的交界处可能是其主要活性位点,序列保守的β-折叠桶(K_(32)~A_(101))可能在其发挥功能时起重要作用。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 C129R蛋白 e165r蛋白 可溶性表达 酶学活性 结构预测
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稳定表达非洲猪瘟病毒E165R蛋白PK15细胞系的构建 被引量:2
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作者 刘文豪 朱彦策 +2 位作者 张冬萱 王智豪 张超 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2662-2666,共5页
旨在构建稳定表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)E165R蛋白的PK 15细胞系。ASFV E165R基因经PCR扩增连接到p3×FLAG-CMV-10载体,再由同源重组连接克隆到慢病毒载体得到重组质粒V2-FLAG-E165R。在HEK 293T细胞中进行... 旨在构建稳定表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)E165R蛋白的PK 15细胞系。ASFV E165R基因经PCR扩增连接到p3×FLAG-CMV-10载体,再由同源重组连接克隆到慢病毒载体得到重组质粒V2-FLAG-E165R。在HEK 293T细胞中进行慢病毒包装得到慢病毒颗粒并转导至PK 15细胞中,经嘌呤霉素初筛得到的多克隆细胞,接着以终点稀释法筛选获得稳定表达E165R蛋白的单克隆PK 15细胞系。通过PCR扩增、Western blot和间接免疫荧光鉴定构建的PK 15细胞系,进一步利用RT-qPCR技术检测NF-κB及炎症相关基因P65、IKBa、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平。结果表明,稳定过表达ASFV E165R蛋白的PK 15稳定细胞系构建成功,与对照细胞系相比,E165R蛋白显著增强NF-κB以及炎症相关基因IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达。本结果为后续研究ASFV E165R对先天免疫信号通路的影响提供生物材料。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 e165r蛋白 细胞系 NF-ΚB
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基于E165R基因非洲猪瘟LAMP快速检测方法的建立 被引量:2
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作者 林涛 陈珺煜 +3 位作者 王成龙 李芹 张怀东 刘峰 《贵州农业科学》 CAS 2023年第3期82-88,共7页
【目的】建立特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)快速检测方法,为非洲猪瘟的实时实地快速检测提供参考。【方法】通过对非洲猪瘟病毒多种... 【目的】建立特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)快速检测方法,为非洲猪瘟的实时实地快速检测提供参考。【方法】通过对非洲猪瘟病毒多种基因型66个毒株的E165R基因多序列比对,选取相对保守区域设计LAMP引物,并对反应条件及反应体系进行优化。在获得的最优反应条件及体系下考察方法的检测特异性和灵敏性。【结果】选取的LAMP检测靶标235 bp(29~264 bp)在不同基因型ASFV毒株中保守性较好,序列相似度达94.46%~100%;LAMP反应的最佳温度为64℃、时间为35 min、Mg 2+浓度为8 mmol/L、内外引物比为8︰1、Bst DNA聚合酶量为16 U。建立的ASFV环介导等温扩增检测方法最低检测限为50 copies/μL,较常规PCR检测提高1个数量级,且35 min即可完成扩增反应。LAMP检测方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)4种临床症状类似的猪病毒感染性疫病没有交叉反应。【结论】基于该新检测靶点的ASFV LAMP检测具有良好的特异性,可成功区分与ASFV感染临床症状相似的猪感染性疾病,且灵敏度优于常规PCR检测方法,方法简单、检测成本低,可实现ASFV的特异、灵敏、快速检测。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 e165r基因 环介导等温扩增 快速检测 特异性 灵敏性
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非洲猪瘟病毒复制相关基因E165R启动子预测及其甲基化分析 被引量:4
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作者 张彦兵 张石磊 +2 位作者 刘良波 谢全亮 孙延鸣 《中国猪业》 2021年第4期51-56,共6页
ASF(非洲猪瘟)是由ASFV(非洲猪瘟病毒)引起猪的一种烈性、急性、出血性传染病。ASFV基因组为双股线性DNA(170~190 kb),可编码150~200种病毒,已报道ASFV的E165R基因与其复制相关,E165R编码的dUTPase蛋白结构已被解析。本文旨在利用软件... ASF(非洲猪瘟)是由ASFV(非洲猪瘟病毒)引起猪的一种烈性、急性、出血性传染病。ASFV基因组为双股线性DNA(170~190 kb),可编码150~200种病毒,已报道ASFV的E165R基因与其复制相关,E165R编码的dUTPase蛋白结构已被解析。本文旨在利用软件和数据库对基因E165R的启动子进行生物信息学分析,进而分析其甲基化。首先,针对不同毒株的E165R启动子序列进行同源进化树分析,结果显示E165R启动子序列高度保守;然后,利用软件和数据库分析E165R启动子活性区域和转录因子,发现E165R启动子含有3个活性区域,启动子含有Sp1、c-Jun和C/EBPalp等6种转录因子,在Sp1、Oct-1和C/EBPalp结合序列上含有cg甲基化位点;最后,成功预测E165R启动子甲基化区域并设计了甲基化检测引物。本研究,首次从DNA甲基化角度出发,对ASFV的E165R基因启动子进行生物信息学分析,为下一步研究DNA甲基化影响ASFV的复制打下基础。 展开更多
关键词 ASFV e165r 生物信息 启动子 DNA甲基化
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FoxJ1 inhibits African swine fever virus replication and viral S273R protein decreases the expression of FoxJ1 to impair its antiviral effect 被引量:3
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作者 Caina Ma Shasha Li +8 位作者 Fan Yang Weijun Cao Huisheng Liu Tao Feng Keshan Zhang Zixiang Zhu Xiangtao Liu Yonghao Hu Haixue Zheng 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2022年第3期445-454,共10页
African swine fever(ASF)is a highly pathogenic swine infectious disease that affects domestic pigs and wild boar,which is caused by the African swine fever virus(ASFV).ASF has caused huge economic losses to the pig in... African swine fever(ASF)is a highly pathogenic swine infectious disease that affects domestic pigs and wild boar,which is caused by the African swine fever virus(ASFV).ASF has caused huge economic losses to the pig industry and seriously threatens global food security and livestock health.To date,there is no safe and effective commercial vaccine against ASF.Unveiling the underlying mechanisms of ASFV-host interplay is critical for developing effective vaccines and drugs against ASFV.In the present study,RNA-sequencing,RT-qPCR and Western blotting analysis revealed that the transcriptional and protein levels of the host factor FoxJ1 were significantly down-regulated in primary porcine alveolar macrophages(PAMs)infected by ASFV.RT-qPCR analysis showed that overexpression of FoxJ1 upregulated the transcription of type I interferon and interferon stimulating genes(ISGs)induced by poly(dA:dT).FoxJ1 revealed a function to positively regulate innate immune response,therefore,suppressing the replication of ASFV.In addition,Western blotting analysis indicated that FoxJ1 degraded ASFV MGF505-2R and E165R proteins through autophagy pathway.Meanwhile,RT-qPCR and Western blotting analysis showed that ASFV S273R inhibited the expression of FoxJ1.Altogether,we determined that FoxJ1 plays an antiviral role against ASFV replication,and ASFV protein impairs FoxJ1-mediated antiviral effect by degradation of FoxJ1.Our findings provide new insights into the antiviral function of FoxJ1,which might help design antiviral drugs or vaccines against ASFV infection. 展开更多
关键词 African swine fever virus(ASFV) FoxJ1 ISGs MGF505-2R e165r S273R
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