基于E184L基因的非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高度接触性传染病。由于ASFV的感染机制极为复杂,基因型多,至今尚无有效疫苗用于防控,防止该病暴发主要依赖于早期快速诊断和控制。为建立一种高效快速、特异的ASFV检测方法,根据ASFV的E184L基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,建立了检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该方法设计的引物具有高度特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数为0.992,对ASFV核酸最低检测限为1.51拷贝,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等不存在交叉反应。建立的基于ASFV E184L基因实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异地对ASFV核酸进行定量分析,丰富了ASFV的检测方法。

非洲猪瘟病毒E184L基因缺失毒株的构建及评价

为阐明更多非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)未知基因的功能,深入探究ASFV的致病机制,为研制针对ASFV流行毒株的疫苗提供候选毒株。采用同源重组的方法构建E184L基因缺失的非洲猪瘟单基因缺失毒株,在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)中评价其复制特性,并在猪体内比较ASFVΔE184L与亲本毒株ASFV CN/GS/2018对猪的致病力以及在动物体内诱导免疫应答的差异。成功获得了E184L单基因缺失突变毒株ASFVΔE184L,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株E184L基因被成功缺失。复制特性研究发现,E184L基因的缺失削弱了ASFV在PAMs中的复制能力。动物体内试验显示,ASFVΔE184L接种猪在观察期内死亡1头,其余全部存活,而ASFV WT接种猪全部死亡,说明E184L的缺失导致ASFV的毒力显著下降。此外,与亲本毒株相比,ASFVΔE184L可诱导机体ASFV特异性抗体的产生及抗病毒因子干扰素β(interferon-β,IFN-β)的分泌。E184L为ASFV毒力相关基因及免疫抑制相关基因,其基因缺失毒株在猪体内的致病力显著减弱并能诱导机体内更强的免疫应答。以上结果为ASFV未知基因功能及其致病机制的阐明提供了新的理论依据,更重要的是,为在候选疫苗基因组中进一步缺失E184L基因片段构建安全有效的双基因或多基因缺失候选疫苗株奠定了重要基础。