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基于非洲猪瘟病毒E199L蛋白间接ELISA方法的建立 被引量:6
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作者 范婷婷 何希君 张险峰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期41-46,共6页
为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)间接ELISA抗体的检测方法,本研究从ASFV Pig/HLJ/2018株基因组中经PCR扩增E199L基因序列,将其克隆至p ET-32a(+)原核表达载体进行表达并纯化,表达的蛋白经SDS-PAGE和western blot鉴定后,用纯化的重组E199L蛋白(... 为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)间接ELISA抗体的检测方法,本研究从ASFV Pig/HLJ/2018株基因组中经PCR扩增E199L基因序列,将其克隆至p ET-32a(+)原核表达载体进行表达并纯化,表达的蛋白经SDS-PAGE和western blot鉴定后,用纯化的重组E199L蛋白(rE199L)作为包被抗原,利用矩阵法优化各反应条件,建立了检测ASFV E199L蛋白抗体的间接ELISA方法,并检测了该方法的特异性、敏感性和重复性。利用该方法及进口商品化试剂盒对196份猪临床血清样品进行检测,计算二者的符合率。SDS-PAGE及western blot结果显示,正确表达并纯化了rE199L,且rE199L具有良好的反应原性。间接ELISA方法反应条件的优化结果为:rE199L最佳包被浓度为4μg/mL;最佳血清稀释度1:100,37℃作用45 min;5%脱脂乳37℃封闭60 min;兔抗猪HRP-IgG最佳稀释度为1:10000,37℃孵育60 min。建立的该方法除了对ASFV阳性猪血清检测结果为阳性外,对PRRSV、PEDV、CSFV、PCV、PPV和PRV阳性猪血清均为阴性结果;敏感性试验结果显示,该方法可检测阳性血清的最大倍数为1:1600;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%。196份临床猪血清样品的检测结果显示,该间接ELISA方法的阳性检出率为89.3%(175/196),阴性样品检出率为10.7%(21/196);商品化试剂盒的阳性检出率为90.8%(178/196),阴性样品检出率为9.2%(18/196)。二者的符合率为98.3%。建立的该方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以满足临床检测和实验评价的需求,为ASFV抗体检测提供更多的方法选择。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 e199l 原核表达 间接ELISA
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African Swine Fever Virus Protein E199L Promotes Cell Autophagy through the Interaction of PYCR2 被引量:11
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作者 Sheng Chen Xinheng Zhang +5 位作者 Yu Nie Hongxin Li Weiguo Chen Wencheng Lin Feng Chen Qingmei Xie 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2021年第2期196-206,共11页
African swine fever virus(ASFV),as a member of the large DNA viruses,may regulate autophagy and apoptosis by inhibiting programmed cell death.However,the function of ASFV proteins has not been fully elucidated,especia... African swine fever virus(ASFV),as a member of the large DNA viruses,may regulate autophagy and apoptosis by inhibiting programmed cell death.However,the function of ASFV proteins has not been fully elucidated,especially the role of autophagy in ASFV infection.One of three Pyrroline-5-carboxylate reductases(PYCR),is primarily involved in conversion of glutamate to proline.Previous studies have shown that depletion of PYCR2 was related to the induction of autophagy.In the present study,we found for the first time that ASFV E199 L protein induced a complete autophagy process in Vero and HEK-293 T cells.Through co-immunoprecipitation coupled with mass spectrometry(Co IP-MS)analysis,we firstly identified that E199 L interact with PYCR2 in vitro.Importantly,our work provides evidence that E199 L down-regulated the expression of PYCR2,resulting in autophagy activation.Overall,our results demonstrate that ASFV E199 L protein induces complete autophagy through interaction with PYCR2 and down-regulate the expression level of PYCR2,which provide a valuable reference for the role of autophagy during ASFV infection and contribute to the functional clues of PYCR2. 展开更多
关键词 African swine fever virus(ASFV) e199l Pyrroline-5-carboxylate reductase 2(PYCR2) AUTOPHAGY
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