E1A基因对头颈部淋巴结转移鳞癌细胞体外生长的抑制和化放疗增敏的作用

背景与目的:腺病毒5型早期区1A基因(early region 1A,E1A)是新近发现的一个具有抑癌作用的基因,E1A蛋白能够从正、负两种途径调控多种基因的表 达,具有诱导肿瘤细胞分化、逆转其恶性表型、降低其体内致瘤性和抗转移等活性,但E1A基因在头颈淋巴结转移鳞癌治疗中的作用尚少见报道。本研究的目的是探讨E1A基因对头颈淋巴结转移鳞癌细胞体外生长的抑制作用和化、放疗增敏作用及其初步的作用机理。方法:经脂质体介导,将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒peDNA3-E1A导入人舌鳞癌的淋巴结转移癌细胞系686LN-1。通过测绘生长曲线和计算倍增时间,观察E1A基因对该细胞系生长的抑制作用。用MTT法测定转染E1A基因前后,癌细胞对顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶和博来霉素等化疗药物以及放疗敏感性的改变。流式细胞术和免疫细胞化学染色检测转染前后的细胞周期分布以及p53和HER-2/neu表达情况。结果:转染E1A基因细胞群体生长缓慢,倍增时间延长(是转染空载体细胞的1.48倍)。与686LN-1-vect比较,686LN-1-E1A细胞对顺铂、博来霉素、泰素和射线的敏感性(IC_(50))分别提高了8倍、20倍、10倍和1倍。细胞周期出现G_2/M期阻滞;免疫细胞化学染色显示E1A基因能抑制HER-2/neu的表达。

E1A基因对裸鼠移植瘤生长抑制及其初步作用机制的实验研究

目的:探讨E1A基因对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其相关作用机制。方法:通过裸鼠移植瘤实验,观察E1A基因对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤生长的的抑制作用。采用免疫组织化学染色检测E1A基因对肿瘤细胞凋亡及Survivin基因和Caspase-3基因表达的影响。结果:裸鼠移植瘤实验结果显示:Hela-E1A细胞形成的肿瘤较Hela和Hela-vect的出瘤时间晚,生长慢,瘤重小,抑瘤率分别为83.42%和84.74%。免疫组织化学染色显示:E1A基因组细胞凋亡数量较Hela和Hela-vect组明显增多,Caspase-3基因(凋亡促进因子)呈高表达,Survivin基因(调亡抑制因子)的表达明显降低。结论:E1A基因能够明显抑制人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的生长,该作用可能与E1A基因激活Caspase-3基因和降低Survivin基因的表达有关。

E1A基因对人肺腺癌细胞化疗敏感性的影响

目的：探讨Ｅ１Ａ基因对人肺腺癌细胞的化疗增敏作用。方法：通过脂质体介导将Ｅ１Ａ基因导入人肺腺癌细胞系Ａ－ｎｉｐ９７３，经Ｇ４１８筛选获得稳定表达Ｅ１Ａ的转染细胞（Ａｎｉｐ９７３－Ｅ１Ａ）。用不同浓度顺铂、泰素及ＶＰ１６等化疗药物处理细胞，观察Ｅ１Ａ基因对人肺腺癌细胞的化疗增敏作用。结果：Ａｎｉｐ９７３－Ｅ１Ａ细胞对顺铂、泰素的敏感性显著增加，顺铂的ＩＣ５０值减少了７倍，并且敏感性随时间的延长而增加。但对ＶＰ１６，Ｅ１Ａ基因的稳定表达在该细胞系未显示增敏作用。免疫细胞化学染色显示，Ｅ１Ａ基因抑制了ＨＥＲ－２／ｎｅｕ的表达。结论：Ｅ１Ａ基因能增加人肺腺癌细胞对顺铂、泰素等化疗药物的敏感性。该作用可能与Ｅ１Ａ基因抑制ＨＥＲ－２／ｎｅｕ的表达有关。为在恶性肿瘤治疗上化疗和基因治疗联合应用的可能性提供了实验依据。

E1A基因对人宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的探讨E1A基因对人宫颈细胞化疗药物的增敏作用及其相关机制。方法E1A基因经PEI-Fe3O4纳米粒介导转染人宫颈癌细胞系,用不同浓度的顺铂、5-氟尿嘧啶和紫杉醇处理细胞,通过MTT法测绘细胞存活曲线,观察E1A基因对顺铂、5-氟尿嘧啶和紫杉醇等化疗药物敏感性的影响;用同一浓度的顺铂、5-氟尿嘧啶和紫杉醇处理细胞,观察E1A基因在不同时间对癌细胞存活率的影响。结果转染E1A基因的人宫颈癌细胞(Hela-E1A)对顺铂和紫杉醇的敏感性显著增加,与Hela和Hela-vect细胞系比较,Hela-E1A细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性分别提高了10倍和15倍;对5-氟尿嘧啶的增敏作用不明显。结论E1A基因能显著提高人宫颈癌细胞对顺铂和紫杉醇等化疗药物的敏感性。其作用机制可能是E1A基因抑制了该细胞的HER-2/neu基因的表达,使该细胞周期再分布,出现S期抑制和G2/M期阻滞。

PEI-Fe_3O_4纳米粒E1A基因对人宫颈癌细胞周期的影响

目的探讨PEI-Fe3O4纳米粒E1A基因对人宫颈癌细胞周期的影响,为进一步研究E1A基因对宫颈癌放、化疗增敏提供实验依据。方法取对数生长的人宫颈癌细胞(Hela)、对照空载体细胞(Hela-vect)、转染E1A基因的人宫颈癌细胞(Hela-E1A),使用流式细胞仪(Coulter-profiloⅡ型)测定DNA含量,计算机分析细胞周期。结果Hela-E1A组与Hela及Hela-vect组比较,S期细胞比例明显下降,G2/M期细胞比例明显增多,G1期无明显变化。结论PEI-Fe3O4纳米粒E1A基因能改变人宫颈癌细胞周期的分布,使该细胞周期出现S期抑制和G2/M期阻滞,为进一步研究E1A基因对宫颈癌放、化疗增敏提供了实验依据。

包裹E1A基因的纳米粒子制备及转染人肺腺癌细胞A549实验研究

目的制备包裹E1A基因(腺病毒早期表达基因)的纳米粒子,并观察其介导E1A基因转染人肺腺癌细胞A549的可行性和效率。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人肺腺癌细胞A549,并以阳离子脂质体为对照,用PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A基因DNA整合和mRNA表达。结果制备的纳米粒子粒径为150～280nm,包埋率为0.78%,体外释放约为22d;在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数较脂质体组多(P<0.05);PCR、RT-PCR结果表明纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因整合和mRNA表达。结论成功制备了纳米粒子,纳米粒子可携带外源基因进行基因转染。

E1A基因对裸鼠移植瘤化疗增敏的实验研究

目的探讨E1A基因对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤化疗的增敏作用及其相关作用机制。方法通过E1A基因对裸鼠移植瘤化疗增敏实验,观察E1A基因对裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响;采用RT-PCR鉴定E1A在肿瘤细胞中的表达及E1A转染后对HER-2/neu基因表达的影响。结果E1A基因化疗增敏实验结果显示:E1A基因组裸鼠肿瘤体积缩小最明显,肿瘤重量明显小于对照组及空载体组(均P<0.05);而后两组差异无显著性(P>0.05)。RT-PCR结果显示:E1A基因在宫颈癌细胞中能稳定表达并且显著降低HER-2/neu在宫颈癌细胞中的表达水平。结论E1A基因能够显著增加紫杉醇对裸鼠移植瘤的药物敏感性。该作用机制可能与E1A基因降低HER-2/neu蛋白的表达有关。

E1A基因对裸鼠移植瘤细胞凋亡及Survivin、Caspase-3基因表达的影响

目的探讨E1A基因对裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡的影响及其相关作用机制。方法采用免疫组织化学染色检测E1A基因对裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡及Survivin基因和Caspase-3基因表达的影响。结果免疫组织化学染色显示:E1A基因组肿瘤细胞凋亡数量较多,Caspase-3基因呈高表达,Survivin基因表达较弱;而Hela和Hela-vect组肿瘤细胞凋亡数量较少,Survivin基因呈高表达,Caspase-3基因表达较弱。结论E1A基因能够明显促进裸鼠移植瘤肿瘤细胞的凋亡,该作用可能与E1A基因激活Caspase-3基因和抑制Survivin基因的表达有关。

腺病毒E1A基因对吸烟所致肺泡上皮细胞IL-8表达的影响

目的 探讨腺病毒E1A基因对吸烟所致肺泡上皮细胞IL-8表达的影响。方法 通过脂质体转染的方法,将腺病毒E1A基因转染肺泡上皮细胞(A549细胞),经G418筛选、Western blot鉴定E1A阳性表达A549细胞单克隆,不同浓度的香烟提取物(CSE)活化,测定细胞IL-8 mRNA表达和上清液中IL-8浓度。结果 与未转染和对照质粒转染A549细胞相比较,经CSE活化后E1A阳性表达A549细胞IL-8 mRNA表达和蛋白释放显著增加。结论 腺病毒E1A基因显著增加吸烟所致的肺泡上皮细胞IL-8表达,提示腺病毒潜伏感染可能通过放大吸烟所致的气道炎症反应在慢性阻塞性肺疾病的发病中发挥重要作用。

E1A基因对裸鼠移植瘤生长的抑制和化学治疗的增敏作用

目的 探讨E1A基因对人舌鳞状细胞癌淋巴结转移癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用和化学治疗 (化疗 )增敏作用及其相关机理。方法 通过裸鼠致瘤实验 ,观察了E1A基因的抑瘤作用。通过模拟E1A基因治疗临床应用的裸鼠实验 ,观察E1A基因及其与博来霉素联合应用在动物体内的疗效。采用免疫组织化学染色检测E1A基因对HER 2 /neu表达的影响。结果 裸鼠致瘤实验结果显示 :6 86LN 1 E1A细胞形成的肿瘤较 6 86LN 1和 6 86LN 1 vect的出瘤时间晚 ,生长慢 ,瘤重小 ,抑瘤率为 71 8%。模拟E1A基因治疗临床应用的裸鼠实验结果显示 :与对照组相比 ,博来霉素组、E1A基因组和E1A基因加博来霉素组的抑瘤率分别为 :5 3 1%、76 8%和 96 7% ,与博来霉素组相比 ,E1A基因加博来霉素组的抑瘤率为 :92 8%。免疫组织化学染色显示E1A基因能抑制HER 2 /neu的表达。结论 E1A基因能够明显抑制人舌鳞状细胞癌淋巴结转移癌细胞裸鼠移植瘤的生长并显著增加其对博来霉素敏感性 ,具有较好的临床应用前景 ,该作用可能与E1A基因抑制HER 2 /neu的表达有关。

腺病毒5型E1A基因对永生化人支气管上皮细胞生长的抑制作用及其机理

腺病毒 5型早期区 1 A( Ad5E1 A)基因是新近发现的一个肿瘤抑制基因 .其产物 E1 A蛋白是多功能转录因子 ,它能从正、负 2个途径调控多种细胞基因的转录 ,具有降低体内致瘤性及抗转移等活性 .为了探讨 E1 A基因对代表肺癌癌前病变的永生化人支气管上皮细胞的生长是否具有抑制作用 ,构建了在真核细胞高表达 E1 A基因的重组质粒 p CEP4- E1 A.通过脂质体介导将 E1 A基因转入永生化人支气管上皮细胞第 1 68代 ( MP1 68)中 ,经潮霉素筛选 ,获得稳定表达 E1 A的永生化人支气管上皮细胞 ( MP1 68- E1 A) .结果表明 :E1 A基因的稳定表达抑制了 HER- 2 / neu基因的表达 .转染细胞 ( MP1 68- E1 A)回复扁平形态、恢复细胞生长的接触性抑制 ,细胞群体生长缓慢 (倍增时间是 MP1 68- vect细胞的 1 .41倍 ) ,细胞周期 G1期阻滞并出现凋亡 ,软琼脂集落形成抑制率达73.86% .结果说明 E1 A基因的稳定表达明显抑制了永生化人支气管上皮细胞的生长 .该作用可能与 E1 A抑制 HER- 2 / neu基因的表达及诱导永生化人支气管上皮细胞凋亡有关 .

腺病毒5型E1A基因转染前后乳腺癌细胞相关指标水平的变化

目的本研究旨在探讨E1A基因对乳腺癌细胞凋亡的影响,为乳腺癌E1A基因治疗的可行性提供理论和实验依据。方法①构建E1A基因真核表达质粒pEGFP-E1A:通过酶切反应获得E1A基因,琼脂糖凝胶回收后,连接入pEGFP-C1载体EcoRⅠ和BamHⅠ位点中。②E1A基因转染乳腺癌细胞系:脂质体介导将E1A基因转入乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株,经筛选获得稳定表达E1A基因的转染试验组细胞。③RT-PCR检测E1A基因的mRNA表达、west-ern-blot检测E1A蛋白表达。流式细胞仪观察细胞凋亡率、免疫组化法检测HER-2/neu基因的表达水平,对比各组间的差异。结果与对照组、空载体组相比,转染E1A基因后,ElA RNA和蛋白表达明显增高。SK-BR-3肿瘤细胞HER-2/neu的表达明显降低,凋亡率增高。结论本实验成功构建并稳定表达了E1A基因质粒,明显抑制乳腺癌细胞的生长,说明E1A基因在乳腺癌基因治疗中有重要意义,为其临床应用提供了理论和实验依据。

E1A基因对人宫颈癌细胞放射增敏的实验研究

目的探讨E1A基因对人宫颈癌细胞的放射增敏作用及其初步的作用机制。方法将人宫颈癌细胞(Hela)、转染空载体纳米粒的人宫颈癌细胞(Hela-vector)及转染E1A基因的人宫颈癌细胞(Hela-E1A)分别给以0、2、4、6和8Gy的6MV-X线照射,用集落形成法计算细胞存活分数及放射增敏比(SER),检测E1A基因对人宫颈癌细胞对放射线敏感性的影响;采用RT-PCR检测E1A基因的表达以及E1A基因对Her-2基因表达的影响,采用流式细胞术检测E1A基因对细胞周期的影响。结果集落形成实验结果显示:经不同剂量照射后Hela-E1A组平均细胞存活分数明显低于Hela和Hela-vector组,而后两组相近。Hela-E1A组D0值为1.23,Hela和Hela-vector组D0值分别为2.51和2.59,放射增敏比(SER)=(2.04);RT-PCR结果显示:E1A基因在Hela细胞中能稳定表达,E1A基因的转染明显降低了Her-2基因在Hela细胞中的表达水平;流式细胞术结果显示:转染E1A基因后,细胞周期出现S期抑制,G2期阻滞。结论E1A基因能够明显提高人宫颈癌细胞对放射线的敏感性,其作用机制可能与E1A基因抑制了该细胞Her-2基因的表达,使细胞周期再分布有关。

腺病毒5型E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响

目的探讨E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响。方法双酶切质粒pUC119-E1A,获得E1A基因,连接入pEGFP-C1载体,构建真核表达质粒pEGFP-E1A。经脂质体介导转染人乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株,经筛选获得稳定表达E1A基因的转染细胞。RT-PCR检测E1A基因的mRNA转录水平。体外观察各组细胞软琼脂集落及对抗肿瘤药物顺铂的敏感性。结果RT-PCR结果显示,只有重组质粒pEGFP-E1A转染的细胞在约380 bp处有一特异性扩增条带,与未转染组和空载体转染组相比,转染E1A基因后,SK-BR-3肿瘤细胞在软琼脂中形成的集落明显变小,集落形成率明显降低,对顺铂的敏感性明显提高。结论已成功构建E1A基因表达质粒,并稳定表达了E1A基因,表达产物明显抑制乳腺癌细胞的生长,有效提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为其临床应用提供了理论和实验依据。

香烟提取物和腺病毒E1A基因对肺泡上皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:探讨香烟提取物(CSE)致肺泡上皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的作用及腺病毒E1A基因的影响。方法:通过脂质体转染的方法将腺病毒E1A基因转染A549细胞,获取E1A阳性表达A549细胞,不同浓度的CSE活化,测定细胞ICAM-1的表达。结果:CSE显著增加A549细胞ICAM-1表达,且呈浓度依赖性;与未转染和对照质粒转染A549细胞相比较,CSE活化后E1A阳性表达A549细胞ICAM-1表达显著增加。结论:CSE能够诱导肺泡上皮细胞ICAM-1表达,而腺病毒E1A基因显著增加CSE所致的肺泡上皮细胞ICAM-1表达,提示腺病毒潜伏感染放大吸烟所致的气道炎症反应。

腺病毒5型E1A基因转染前后乳腺癌细胞相关指标水平的变化探讨

目的探讨腺病毒5型E1A基因转染前后乳腺癌细胞相关指标水平的变化.方法：建立E1A 基因真核表达质粒pEGFp-E1A,然后进行E1A 基因转染乳腺癌细胞系,以获得稳定表达E1A 基因的转染细胞作为观察组,采用RT-PCR 进行E1A 基因mRNA 表达以及westem-blot的检测,比较组间基因表达情况.结果：转染基因E1A 基因以后,观察组的E1A-RNA 以及蛋白表达均较空白载体组以及对照组显著提高,而SK-BR-3 肿瘤细胞的HER-2/neu表达显著降低,而凋亡率显著增高（P〈0.05）.结论：E1A 基因对于乳腺癌细胞的生长具有明显抑制作用,可作为乳腺癌基因治疗的重要靶点.

聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应

目的以自行合成的聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)纳米凝胶为载体转染E1A基因,并观察E1A基因对肝癌细胞体外生长的抑制作用及其对化疗药物的增敏效应,初步探讨其作用机制。方法经PEI介导,将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌H22细胞,RT-PCR证实其转染,G418筛选出阳性克隆细胞,观察EIA基因对该细胞系生长的抑制作用。用MTT法测定转染E1A基因前后,顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶、博来霉素对肝癌H22细胞的效应。结果质粒psv-E1A测序结果与基因库E1A基因序列完全相符。G418筛选出阳性克隆细胞。RT-PCR结果显示PEI能转染质粒psv-E1A并有稳定的表达。转染E1A基因后,H22-E1A细胞对顺铂、博来霉索、泰素的敏感性显著提高(P<0.01),而对5-氟尿嘧啶的敏感性无明显变化(P>0.05)。结论PEI能正常转染质粒psv-E1A,E1A基因能够明显抑制肝癌H22细胞的生长,并明显提高其对顺铂、博来霉索及泰素等化疗药物和放射线的敏感性。其机制可能与E1A基因改变肿瘤细胞的增殖状态和细胞周期时相有关。

腺病毒E1A基因对肺泡上皮细胞ICAM-1表达的影响

目的 探讨腺病毒E1A基因对细菌脂多糖(LPS)所致肺泡上皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法 通过脂质体转染的方法将腺病毒E1A基因转染肺泡上皮细胞(A549细胞)，经G418筛选、Westem blot鉴定E1A阳性表达A549细胞单克隆，不同浓度的LPS活化，测定不同时间细胞ICAM-1表达。结果 与未转染和空质粒转染A549细胞相比较，经LPS活化后E1A阳性表达A549细胞ICAM-1表达显著增加，且呈浓度和时间依赖性。结论 腺病毒E1A基因显著增加LPS所致的气道上皮细胞ICAM-1表达，提示腺病毒潜伏感染可能通过放大外界刺激因素所致的气道炎症反应在COPD的发病中发挥重要作用。