miR-372靶向E2F转录因子5抑制宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞的恶性生物学行为

目的:探讨微小RNA-372(miR-372)对宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞恶性生物学行为的影响及其可能作用机制。方法:RT-qPCR检测宫颈鳞状细胞癌组织及其癌旁组织中miR-372和E2F转录因子5(E2F5)表达水平,构建miR-372过表达和低表达SiHa细胞系(miR-372、anti-miR-372),采用MTT法、流式细胞术、Transwell法及Western blot分别检测细胞增殖、凋亡、侵袭情况及其相关蛋白水平。在线预测miR-372与E2F5靶向关系并进行双色荧光素酶实验验证,在miR-372过表达SiHa细胞系上调E2F5,观察细胞增殖、凋亡和侵袭情况。结果:癌组织中miR-372表达低于其癌旁组织(P<0.05),而E2F5表达高于其癌旁组织(P<0.05)。miR-372过表达抑制细胞增殖、侵袭和核蛋白(Ki67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(cyclin A1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)表达(P<0.05);上调细胞凋亡和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)、Caspase-3、B淋巴细胞瘤2蛋白/Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2/Bax)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达(P<0.05)。miR-372可靶向抑制E2F5表达,E2F5过表达可缓解miR-372对SiHa细胞作用效果。结论:miR-372过表达可抑制SiHa细胞增殖和侵袭、促进细胞凋亡,可能与靶向作用抑制E2F5表达有关。

微小RNA-20b-5p/E2F转录因子5介导转化生长因子-β1调节前列腺癌细胞上皮-间充质转化的作用机制研究

目的探讨前列腺癌细胞中微小RNA(miR)-20b-5p/E2F转录因子5(E2F5)介导转化生长因子-β1(TGF-β1)调节前列腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT),从而促进前列腺癌发生发展的作用机制。方法分析数据库,预测miR-20b-5p的靶基因,双荧光报告基因检测miR-20b-5p对E2F5 mRNA的3’UTR的靶向抑制。E2F5的野生型(WT)及突变型(Mut)的3’端非编码区(3’UTR)分别转染PC3和DU145细胞后,再做TGF-β处理,双荧光报告基因检测E2F5是否是TGF-β和miR-20b-5p的共同靶点。蛋白质印迹法(Western blot)检测miR-20b-5p对E2F5的靶调节。PC3和DU145细胞分别转染miR-20b-5p抑制剂和模拟物及其对照RNA后,Western blot检测miR-20b-5p对E2F5的靶调节。分别取两组前列腺增生和前列腺癌组织进行mRNA基因测序,比较两者E2F5的表达。PC3细胞敲低miR-20b-5p的同时也敲低E2F5,Western blot检测EMT相关基因E-钙黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表达。组间比较应用单因素方差分析。结果预测到的靶基因共有207个,并最终确定E2F5为我们的研究对象,双荧光报告基因检测发现与对照组比较miR-20b-5p对E2F5 mRNA的3’UTR的靶向抑制作用(PC3为103.00±2.00比35.67±2.51,F=1316.258,P<0.01;DU145为101.00±2.00比69.33±1.53,F=475,P<0.01)。与对照组比较TGF-β对E2F5 mRNA的3’UTR的靶向增强作用(PC3为98.67±2.08比155.67±2.08,F=1124.654,P<0.01;DU145为97.33±0.58比143.00±2.00,F=1443.769,P<0.01),E2F5是TGF-β和miR-20b-5p的共同靶点。PC3和DU145细胞分别转染miR-20b-5p抑制剂和模拟物及其对照RNA后,miR-20b-5p抑制物组E2F5表达高于对照组(PC3组为1.23±0.16比0.83±0.02,P<0.01;DU145组为0.49±0.2比0.31±0.02,P<0.01),相反,miR-20b-5p抑制物组E2F5表达低于对照组(PC3组为0.63±0.02比0.82±0.02,P<0.01。DU145组为0.14±0.02比0.30±0.02,P<0.01),说明miR-20b-5p对E2F5的靶向负调节作用。mRNA基因测序发现E2F5在前列腺癌中表达显著高于对照组,并且分析TCGA数据库显示E2F5在前列腺癌组织中高表达。敲低miR-20b-5p后E-cadherin的表达低于对照组,而同时敲低E2F5后又能够扭转这个趋势[分别为0.43±0.02和0.98±0.02,与对照组(0.95±0.02)比较,F=817.515,P<0.01],与之相反,敲低miR-20b-5p,Vimentin的表达高于对照组,而同时敲低E2F5后又能够扭转这个趋势[分别为0.75±0.02和0.18±0.02,与对照组(0.15±0.02)比较,F=832.089,P<0.01],说明E2F5通过靶向调控E2F5从而调控EMT表型蛋白E-cadherin及Vimentin表达,导致前列腺癌的发生发展。结论miR-20b-5p/E2F5介导TGF-β1调节前列腺癌细胞EMT的作用从而导致前列腺癌的进展。

微小RNA-373靶定E2F转录因子5降低胶质瘤细胞恶性表型

目的观察微小RNA（miRNA，miR）-373对胶质瘤细胞恶性表型的影响，探讨miR-373调控胶质瘤发生发展的分子机制。方法利用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测胶质瘤组织及正常脑组织中miR-373的表达水平；利用噻唑蓝（MTT）比色法及Transwell侵袭实验检测miR-373对胶质瘤细胞U251活性及侵袭能力的影响；通过生物信息学方法，筛选miR-373的靶基因，利用荧光报告载体实验结合Real-time PCR和Western blot验证miR-373对靶基因的直接调控作用。结果将正常脑组织和人正常星形细胞株中miR-373的表达水平标化为1，胶质瘤组织和U251、U87、A172、U118细胞中miR-373的相对表达水平分别为0.36±0.14、0.21±0.04、0.32±0.05、0.35±0.04、0.56±0.12，差异有统计学意义（t＝－7.862，P＝0.006；t＝－9.211，P＝0.004；t＝－8.090，P＝0.005；t＝－7.953，P＝0.006；t＝－6.254，P＝0.007）。miR-373转染U251细胞48 h后，细胞活性和侵袭能力与对照组比较显著降低[活性：0.25±0.03比0.63±0.08；穿膜细胞数：（41.5±5.7）个比（118.5±9.8）个；t＝－12.561，P＝0.002；t＝－10.792，P＝0.003]。过表达miR-373后，含有E2F转录因子5的3’端非编码区域（E2F5 3’UTR）的荧光报告载体的细胞组荧光值为1.49±0.21，对照组的荧光值为2.23±0.32，差异有统计学意义（t＝－9.804，P＝0.004）。结论miR-373通过靶向抑制E2F5表达降低胶质瘤细胞的恶性生物学活性。

前列腺癌组织miR-613和E2F转录因子5表达变化及其与临床病理特征的关系

目的观察前列腺癌组织miR-613和E2F转录因子5(E2F transcription factor 5, E2F5)表达变化,探讨其与前列腺癌临床病理特征及预后的关系。方法 79例前列腺癌患者均行根治性前列腺切除术+辅助化疗。采用实时荧光定量PCR法检测手术切除前列腺癌组织及癌旁正常组织miR-613和E2F5 mRNA相对表达量,比较前列腺癌组织与癌旁正常组织、不同临床病理特征前列腺癌患者癌组织miR-613和E2F5 mRNA相对表达量,Pearson相关法分析癌组织miR-613与E2F5表达的相关性。依据前列腺癌组织miR-613和E2F5 mRNA相对表达量,将前列腺癌患者分为miR-613高表达组(miR-613相对表达量≥1.63)39例和miR-613低表达组(miR-613相对表达量<1.63)40例,E2F5高表达组(E2F5 mRNA相对表达量≥1.19)42例和E2F5低表达组(E2F5 mRNA相对表达量<1.19)37例。随访3年,比较miR-613和E2F5高、低表达组前列腺癌患者的生存情况。结果前列腺癌组织miR-613相对表达量(1.62±0.47)低于癌旁正常组织(2.98±1.06)(P<0.05),E2F5 mRNA相对表达量(1.18±0.39)高于癌旁正常组织(0.42±0.13)(P<0.05)。癌组织miR-613相对表达量在Gleason评分≥8分(1.06±0.39)、有淋巴结转移(0.53±0.16)、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期者(0.80±0.23)分别低于Gleason评分<8分、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期者(1.93±0.82、1.76±0.45、1.97±0.82)(P<0.05),癌组织E2F5 mRNA相对表达量在Gleason评分≥8分(2.07±0.92)、有淋巴结转移(3.75±1.52)、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期者(4.01±1.85)分别高于Gleason评分<8分、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期者(0.69±0.22、0.85±0.38、0.77±0.34)(P<0.05);不同年龄、肿瘤直径及分化程度前列腺癌患者癌组织miR-613和E2F5 mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。前列腺癌组织miR-613表达与E2F5表达呈负相关(r=-0.752,P<0.001)。79例前列腺癌患者的3年总生存率为54.43%;miR-613低表达组3年总生存率(42.50%)低于miR-613高表达组(66.67%)(P<0.05),E2F5高表达组3年总生存率(38.10%)低于E2F5低表达组(72.97%)(P<0.05)。结论前列腺癌组织miR-613表达降低,E2F5表达升高,提示前列腺癌患者TNM分期晚、有淋巴结转移,预后差。

miR-129-3p通过E2F5下调BIM表达在结直肠癌中所起的促癌作用研究

目的探讨miR-129-3p通过E2F5下调BIM表达在结直肠癌中所起的促癌作用。方法收集郑州大学第二附属医院消化内科30例结直肠癌组织和10例癌旁组织样本,生物信息学分析miR-129-3p在样本中的表达差异。qRT-PCR评估miR-129-3p在样本中的表达情况。CCK8实验检测细胞活力。转染mimic和inhibitor改变miR-129-3p表达,探讨miRNA的生物学功能。荧光素酶报告基因检测miRNA靶基因。通过转染siRNA,抑制E2F5的表达。Western blotting检测细胞蛋白表达含量。结果miR-129-3p在结直肠癌组织样本中呈低表达。通过转染mimic和inhibitor发现,提高miR-129-3p表达可以抑制细胞活力。反之,抑制miR-129-3p促进细胞增殖。荧光素酶报告基因和Western blotting检测E2F5可作为miR-129-3p靶基因。敲除miR-129-3p靶基因E2F5同样抑制结直肠癌的增殖。结论miR-129-3p可以通过下调E2F5的表达抑制结直肠癌细胞增殖。miR-129-3p有望成为治疗结直肠癌的新靶点,我们的研究为结直肠癌的靶向治疗提供新思路。

微小核糖核酸miR-613通过下调E2F5的表达抑制前列腺癌细胞增殖

目的研究微小核糖核酸miR-613在前列腺癌组织及细胞系中的表达及其对前列腺癌细胞增殖的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测前列腺癌组织及细胞系中miR-613的表达情况,并检测各组细胞中E2F5 mRNA的表达情况;蛋白质印迹法检测E2F5蛋白的表达;通过细胞增殖实验检测过表达miR-613后细胞的增殖能力;集落形成实验检测单个细胞克隆增殖情况;双荧光素酶报告实验验证miR-613和E2F5是否靶向结合。结果qPCR结果显示,miR-613在前列腺癌组织和细胞系均显示低表达。与Control组相比,转染miR-613组PC3和LnCap细胞中E2F5蛋白表达水平降低,细胞增殖明显受抑制。而在过表达E2F5后,PC3和LnCap细胞增殖又明显回升,可逆转miR-613的调节作用。双荧光素酶报告实验结果表明,miR-613能够直接靶向E2F53′-UTR。结论miR-613能够通过下调E2F5转录因子的表达而抑制前列腺癌细胞增殖。

基于miR-138-5p/E2F3信号通路探讨柠檬苦素对人非小细胞肺癌H1299细胞生物学行为的影响

目的:基于微小RNA-138-5p(miR-138-5p)/E2F转录因子3(E2F3)信号通路探讨柠檬苦素对人非小细胞肺癌H1299细胞生物学行为的影响。方法:设H1299细胞组、氟尿嘧啶组(25μg·ml-1)、柠檬苦素低、高剂量组(40,80μg·ml-1),以上各组每孔设6个平行样,培养72 h。培养结束后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞活力,结晶紫染色测定单克隆形成数目,Transwell小室测定细胞侵袭迁移水平,流式细胞仪测定细胞凋亡率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹(Westernblot)法测定细胞miR-138-5p、E2F3 mRNA及蛋白水平。结果:与H1299细胞组比较,氟尿嘧啶组、柠檬苦素低、高剂量组光密度(OD)值、细胞存活率、克隆形成数目、穿膜数目、E2F3 mRNA和蛋白表达水平显著降低,凋亡率、miR-138-5p表达水平显著升高(P<0.05)。与氟尿嘧啶组比较,柠檬苦素低剂量组OD值、细胞存活率、克隆形成数目、穿膜数目、E2F3 mRNA和蛋白表达水平显著升高,凋亡率、miR-138-5p表达水平显著降低(P<0.05);柠檬苦素高剂量组OD值、细胞存活率、克隆形成数目、穿膜数目、E2F3 mRNA和蛋白表达显著降低,凋亡率、miR-138-5p表达水平显著升高(P<0.05)。柠檬苦素高、低剂量组间各指标差异有统计学意义(P<0.05)。结论:柠檬苦素能抑制人非小细胞肺癌H1299细胞增殖、侵袭迁移,促进非小细胞肺癌H1299细胞凋亡;其机制可能与柠檬苦素通过促进H1299细胞miR-138-5p表达,抑制E2F3 mRNA和蛋白表达,进而抑制miR-138-5p/E2F3通路的激活有关。

OrfA与E2F5的互作关系及其对肺腺癌细胞增殖的影响

【目的】确认大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助因子OrfA与转录因子E2F5的互作关系,以及OrfA对肿瘤细胞增殖的影响。【方法】采用重组DNA技术构建orfA与E2F5基因过表达载体;通过Western Blot试验,检测对比HEK293T、Hela229宫颈癌细胞、A375恶性黑色素瘤细胞、SMMC-7721肝癌细胞和SPC-A-1肺腺癌细胞中E2F5的表达量;通过酵母双杂交和免疫共沉淀试验,验证OrfA与E2F5的互作关系;采用CCK-8试剂盒和PI单染色法,检测过表达orfA基因对SPC-A-1细胞增殖的影响;采用RT-qPCR,检测过表达orfA基因对SMAD4和caspase-3基因表达的影响。【结果】成功构建了orfA与E2F5基因过表达载体pLenti-EF1α-orfA和pLenti-EF1α-E2F5;在5种细胞系中,以SPC-A-1细胞E2F5蛋白表达量最高;酵母双杂交和免疫共沉淀试验结果均证明,OrfA与E2F5可以直接相互作用;过表达orfA基因对SPC-A-1细胞增殖具有显著促进作用,同时能够增强SMAD4基因的表达,抑制caspase-3基因的表达。【结论】WDSV OrfA与E2F5有相互作用,且能促进SPC-A-1肺腺癌细胞的增殖。

大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)逆转录病毒周期蛋白(OrfA)相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤(WDS)在秋季发生春季萎缩的季节性生长特点与大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒(WDSV)辅助基因的表达有关.其中辅助基因orfA的表达产物OrfA蛋白可能是1个潜在的肿瘤相关因子,OrfA与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D同源,也被称为逆转录病毒周期蛋白(retroviral-cyclin).为了深入研究OrfA的作用和功能,我们构建了诱饵表达载体pGBKT7-orfA,采用酵母双杂交技术,从HeLa cDNA文库中筛选与其相互的蛋白因子.通过2轮高强度压力的筛选、β-半乳糖苷酶活性验证、回转验证以及测序分析,最终获得了1个与OrfA相互作用的转录因子E2F5.OrfA C端78个氨基酸的多肽或者缺失C端78个氨基酸的OrfA突变体均不能在酵母双杂交系统中与E2F5相互作用.这些发现为进一步研究OrfA在肿瘤萎缩中的功能奠定了基础.

基于E2F5研究强心苷类化合物21-hydroxy-neriaside抑制胃癌细胞增殖的作用机制

目的 探究强心苷类单体化合物21-hydroxy-neriaside的抗胃癌作用及机制。方法 采用CCK-8法考察21-hydroxy-neriaside对胃癌HGC27、MGC803、GT0603和GT112细胞增殖的影响;观察21-hydroxy-neriaside对HGC27、MGC803、GT0603和GT112细胞形态的影响;考察21-hydroxy-neriaside对HGC27、GT0603和GT112细胞集落形成的影响;采用RNA测序探究21-hydroxy-neriaside抑制胃癌细胞增殖的可能机制;采用qRT-PCR验证RNA测序结果;考察shRNA-E2F转录因子5(E2F transcription factor 5,E2F5)对GT112细胞E2F5表达的影响;采用Western blotting检测21-hydroxy-neriaside对HGC27、GT0603和GT112细胞E2F5、骨髓细胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc)、细胞周期D1(Cyclin D1)、细胞周期E2(Cyclin E2)和剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase,cleaved PARP]蛋白表达的影响。结果 CCK-8实验、形态学观察和细胞克隆形成实验均表明21-hydroxy-neriaside具有抑制胃癌细胞增殖的活性,与时间和药物浓度呈正相关。RNA测序、qRT-PCR和shRNA-E2F5慢病毒转染实验表明21-hydroxy-neriaside通过调控E2F5影响细胞周期通路,从而抑制肿瘤细胞生长。Western blotting实验结果表明21-hydroxy-neriaside组细胞中E2F5、c-Myc、Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表达水平均明显降低(P<0.05、0.01、0.001),cleaved PARP蛋白表达水平显著升高(P<0.001)。结论 21-hydroxy-neriaside具有抗胃癌活性,能够通过下调E2F5表达来影响细胞周期通路相关蛋白,抑制胃癌细胞生长,从而促使肿瘤细胞凋亡。