E2F3基因真核表达载体的构建和表达

目的克隆人膀胱肿瘤组织E2F3基因及构建E2F3基因真核表达载体并研究其表达。方法取新鲜膀胱肿瘤组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增E2F3基因,构建其真核表达载体,测序分析及转染膀胱肿瘤细胞,Western Blot法检测其表达情况。结果成功克隆人膀胱肿瘤组织E2F3基因、构建E2F3基因真核表达载体,转染后成功表达。结论人膀胱肿瘤组织E2F3基因克隆及其真核表达载体构建成功,可用于肿瘤生物学的研究。

miR-449a对食管鳞癌细胞Eca-109增殖、迁移、侵袭的影响及机制

目的探讨miR-449a对食管鳞癌细胞Eca-109增殖、迁移、侵袭的影响及其可能的机制。方法将食管鳞癌细胞Eca-109分为miR-449a组和NC组,分别转染miR-449a-mimics和NC-mimics;采用实时荧光定量PCR法检测两组miR-449a相对表达量,miR-449a组miR-449a相对表达量明显高于NC组,证实上调miR-449a表达的Eca-109细胞模型建立成功。采用CCK-8法、平板克隆形成试验检测两组细胞增殖能力(分别以培养12、24、48 h吸光度值和克隆数表示),细胞划痕试验检测细胞迁移能力(以细胞之间的距离表示),Transwell小室试验检测细胞侵袭能力(以侵袭到下室的细胞数量表示),流式细胞仪检测细胞周期比例。采用实时荧光定量PCR法和Western blotting法分别检测两组miR-449a直接靶基因E2F3 mRNA及蛋白相对表达量。结果 miR-449a组细胞培养12、24、48 h时的吸光度值及克隆数、细胞之间的距离、侵袭到下室的细胞数量均低于NC组(P<0.05或<0.01)。miR-449a组G1期细胞比例高于NC组,S期细胞比例低于NC组(P均<0.05);两组G2/M期细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-449a组E2F3 mRNA及蛋白相对表达量均低于NC组(P均<0.01)。结论 miR-449a可抑制食管鳞癌细胞Eca-109的增殖、迁移和侵袭;抑制靶基因E2F3表达可能是其作用机制。

膀胱尿路上皮癌细胞株E2F3基因与miR-17—5p和miR-20a的相互作用

目的研究E2F3基因、miR-17—5p和miR-20a在膀胱尿路上皮癌细胞株中的表达及相互影响，探讨E2F3基因与miR-17—5p和miR-20a在膀胱癌发生中的作用。方法用pcDNA3．1-HA—E2F3和pAAV—siRNA—E2F3质粒在膀胱癌细胞株5637中分别过表达和敲低E2F3基因，用miR-17-5p和miR-20a的模拟物和反义寡核苷分别过表达和敲低miR-17—5p和miR-20a后，实时荧光定量PCR法检测miR-17-5p、miR-20a和E2F3基因的变化，蛋白质印迹法检测E2F3蛋白水平的变化。结果E2F3基因过表达后，miR-17-5p和miR-20a的2值分别为2．26±0．30和4．044-0．51，与对照组（1．00±0．00）比较差异有统计学意义（P〈0．05）；敲低E2F3后，miR-17—5p和miR-20a的2值分别为0．49±0．02和0．65±0．04，与对照组（1．00±0．00）比较差异有统计学意义（P〈0．05）；同时过表达miR．17．5p和miR-20a，E2F3的mRNA水平明显下调，蛋白质平均灰度值为55．31±7．89，对照组为103．67±13．61，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；同时敲低miR17—5P和miR-20a后，E2F3的mRNA比对照显著上调，蛋白质平均灰度值为295．68±19．25，与对照组平均灰度值为103．67±13．61比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论E2F3基因可上调miR-17—5p和miR-20a的表达，miR-17—5p和miR-20a可以下调E2F3基因的表达。E2F3基因、miR-17—5p和miR．20a在膀胱尿路上皮癌中形成调节环路，协调膀胱肿瘤细胞的生长。