叶用莴苣LsE3基因克隆与表达分析

【目的】为探明E3泛素连接酶基因对叶用莴苣高温抽薹的影响。【方法】通过RT-PCR克隆得到LsE3编码序列,生物信息学工具分析序列特征,实时荧光定量PCR方法分析基因表达水平。【结果】LsE3基因长度1 122bp,编码373个氨基酸。生物信息学分析显示,其C端有一个RING-H2finger结构域。多序列比对和系统发育分析表明,该蛋白序列具有较高的保守性,与向日葵(Helianthus annuus L.)亲缘关系较近。LsE3亚细胞定位预测位于细胞核。荧光定量PCR结果显示,高温处理显著影响植株茎中LsE3表达量。【结论】LsE3可能在叶用莴苣高温抽薹中发挥重要作用。

大豆E3泛素连接酶基因GmPUB1的克隆及功能研究

[目的]本研究通过对大豆E3泛素连接酶基因GmPUB1的克隆及在拟南芥中异源表达,探究E3泛素连接酶在大豆生长发育和非生物胁迫中的作用。[方法]克隆大豆E3泛素连接酶基因GmPUB1,并对其进行生物信息学分析。利用qRT-PCR技术分析该基因在不同组织中以及不同胁迫处理下的表达模式。通过洋葱表皮细胞瞬时表达系统对GmPUB1蛋白进行亚细胞定位分析。在拟南芥中异源表达GmPUB1并对其表型进行分析。[结果]GmPUB1基因(Glyma.14g212200)的CDS序列为1320 bp,编码439个氨基酸且该蛋白相对分子质量和等电点分别为48.63×10^3和8.35。qRT-PCR分析发现GmPUB1在开花后30 d的种子中表达最高。在PEG3350、NaCl、4℃及JA等非生物胁迫诱导下,GmPUB1均上调表达。GmPUB1蛋白在整个细胞内分布。过表达GmPUB1的转基因拟南芥株系的千粒质量显著提高,氨基酸含量发生改变,尤其甲硫氨酸含量显著升高,种子萌发率降低。转基因拟南芥株系具有耐盐性,但对干旱以及ABA敏感。[结论]GmPUB1基因可参与调控种子生长发育并响应逆境胁迫。

绵羊痘病毒E3L基因的克隆和表达及其结构分析

以绵羊痘病毒古浪株基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得绵羊痘病毒E3L基因,将其克隆至pGEX4T-1表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株为宿主菌进行了诱导表达。结果显示,重组菌可以表达出大小约为46ku的重组融合蛋白,表达的蛋白绝大部分以可溶形式存在于菌体中;表达产物经GST结合树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白,经Western-blot分析,所纯化的蛋白能与绵羊痘病毒阳性血清进行特异的免疫印迹反应,证明表达的蛋白具有良好的反应原性。用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠获得鼠抗血清,经间接ELISA测定效价为1∶100 000。