泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2高表达与胃癌临床分期、侵袭性及预后的相关性

目的研究泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2(MARCH2)高表达与胃癌分期、侵袭及预后之间的关系。方法将96例行胃癌根治术的胃癌患者纳为研究对象,免疫组织化学法检测患者胃癌组织及癌旁组织内MARCH2表达情况,分析MARCH2阳性表达与患者临床病理特征之间的关系。术后随访5~47个月,采用Kaplan-Meier法分析胃癌组织内MARCH2表达情况与患者生存时间的关系。结果胃癌组织内MARCH2阳性表达率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织内MARCH2阳性表达与胃癌浸润深度以及淋巴结转移有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期以及分化程度无关(P>0.05)。将胃癌组织内MARCH2中、强阳性表达者纳为MARCH2强阳性表达组,其余患者纳为对照组,随访5~47个月,平均(34.51±6.16)个月,绘制生存曲线发现,强阳性组患者生存时间短于对照组,差异具有统计学意义(Rank=8.923,P=0.003)。结论胃癌组织内MARCH2阳性表达率明显上升,且MARCH2阳性表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移间存在密切联系,MARCH2高表达者预后生存时间更短,提示MARCH2可能参与胃癌的发生及发展。

E3泛素连接酶WWP2通过蛋白酶体途径调控p21的稳定性

目的 探讨含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2 (WWP2)调控p21稳定性的潜在作用机制。方法 通过免疫共沉淀及Western blotting检测HEK 293T细胞中WWP2与p21的结合情况。用蛋白酶体抑制剂(MG132)和放线菌酮(CHX)处理过表达或敲减WWP2 HEK 293T细胞0、4、8 h,通过Western blotting检测p21的表达情况。结果 WWP2与p21间存在结合。过表达WWP2的293T细胞中,p21的表达水平明显降低,且随WWP2表达量增加逐渐降低。敲减WWP2的293T细胞中,p21表达水平增加。随着CHX作用时间延长,对照组和实验组的p21表达水平均逐渐下降。过表达组p21半衰期较对照组缩短;敲减组p21半衰期较对照组延长。随着MG132作用时间延长,对照组和实验组p21表达水平均逐渐上升。空载组较过表达组、敲减组较对照组p21积累均更显著。结论 E3泛素连接酶WWP2可与p21结合,并通过蛋白酶体途径降解p21。

向日葵E3泛素连接酶基因的分析定位和表达鉴定

该研究利用前期获得的向日葵耐盐相关基因E3泛素连接酶基因序列(HERC2),构建瞬时表达载体Cam-35S-HERC2-GFP,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位;采用RT-PCR技术,分析盐胁迫下HERC2在耐盐品种P50和盐敏感品种P29根、下胚轴和叶中的表达差异;构建HERC2植物表达载体pPZP221-HERC2,采用农杆菌介导法将HERC2导入烟草,进行耐盐功能验证。结果表明:(1)HERC2蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(2)受到NaCl胁迫后,HERC2基因在耐盐品种P50和盐敏感品种P29中均上调表达,但耐盐品种中的表达量较高。(3)HERC2基因的表达,能够提高转基因烟草的耐盐性。该研究结果为进一步解析向日葵对盐胁迫的响应机制,以及耐盐新品种的选育奠定了基础。

HECW2基因与肿瘤的研究进展

含HECT,C2和WW域E3泛素蛋白连接酶2(HECW2)基因通过调节蛋白质的泛素化和降解过程参与细胞周期调控、信号转导以及细胞死亡等关键的生物学过程。既往有关HECW2基因的研究多聚焦于神经发育障碍与智力障碍等非肿瘤方面,而关于其在肿瘤发生发展中的作用机制的报道较少。近年研究认为HECW2基因在多种肿瘤类型中异常表达,并在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程中发挥重要功能,可影响肿瘤的生物学行为,这为后续探索肿瘤的分子机制提供了新的视角,为肿瘤的个性化靶向治疗奠定了前期基础。

依托咪酯通过下调含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨依托咪酯(ETO)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)在其中发挥的作用机制。方法分别采用0、1、2和3 mg/L的ETO处理人正常肺上皮细胞系BESA-2B和人NSCLC细胞系A549,细胞计数试剂盒法检测细胞活力;将A549细胞随机分为对照组、ETO(3 mg/L)组、ETO+NC组和ETO+WWP2-OE组,后2组分别于ETO处理后转染空载体pcDNA3.1-NC或WWP2过表达载体pcDNA3.1-WWP2,集落形成试验检测细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中WWP2的mRNA表达;STITCH数据库选择与ETO直接相互作用的蛋白质;蛋白质印迹法检测各组细胞中WWP2、增殖、凋亡和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路相关蛋白表达。结果ETO以剂量依赖性方式显著降低A549细胞活力(F=147.923,P<0.001);而对正常肺上皮BESA-2B细胞活力无影响(F=1.427,P=0.126)。不同浓度(0、1、2、3 mg/L)ETO处理A549细胞后,集落形成数量逐渐减少[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(898±38)、(785±48)、(635±36)、(388±20)个],细胞凋亡率逐渐升高[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(2.23±0.65)%、(7.63±0.35)%、(13.24±0.47)%、(18.93±0.36)%],呈剂量依赖性(F=218.732、352.786,均P<0.001)。STITCH数据库预测ETO可通过上调WWP2蛋白表达和下调PTEN蛋白表达与WWP2和PTEN相互作用。与对照组相比,ETO组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达降低,集落形成数量减少,细胞凋亡率升高,增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞增殖抗原Ki67、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)和PTEN蛋白表达降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高,磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt(p-Akt)/Akt比值降低(均P<0.01);与ETO+NC组比较,ETO+WWP2-OE组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达升高,集落形成数量增多,细胞凋亡率降低,PCNA、Ki67、Bcl-2和PTEN蛋白表达增多,Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高(均P<0.01)。结论ETO可抑制A549细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控WWP2的下调和PTEN/PI3K/Akt通路的激活有关。

基于TCGA数据库分析DTX2在肾透明细胞癌组织中表达的临床意义及其对肾癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响

目的:基于TCGA数据库分析Deltex E3泛素连接酶2(DTX2)在肾透明细胞癌(ccRCC)组织中的表达水平及临床意义,探讨DTX2对ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:利用TIMER数据库分析DTX2在泛癌组织中的表达水平,通过UALCAN数据库进一步验证ccRCC组织和癌旁组织中DTX2 mRNA和蛋白表达差异。使用UALCAN数据库中的TCGAccRCC队列数据集,分析ccRCC中DTX2表达与患者临床病理特征的相关性。通过K-M plot数据库分析DTX2表达与ccRCC患者预后的相关性。利用DAVID数据库对DTX2相关基因进行GO和KEGG通路富集分析。通过qPCR法检测DTX2基因在人胚肾293(HEK293)细胞和ccRCC细胞A498、Caki-1中的表达水平。利用siRNA技术分别将DTX2 siRNA及其阴性对照质粒转入A498、Caki-1细胞,采用CCK-8法、平板克隆实验、划痕实验及Transwell侵袭实验分别检测敲低DTX2对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果:TCGA数据库分析结果表明,与癌旁组织相比,ccRCC组织中DTX2 mRNA和蛋白均呈高表达(均P<0.01)。DTX2表达水平与ccRCC患者的病理分期、临床分级、不同亚型和淋巴结转移相关联(均P<0.01),DTX2高表达与患者的不良预后具有相关性(均P<0.01)。GO功能和KEGG通路富集分析结果显示,DTX2表达相关基因主要参与蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢等生物学过程,并主要富集到了mTOR信号通路等与肿瘤的相关信号通路中(均P<0.05)。体外细胞实验结果表明,A498和Caki-1细胞中DTX2表达水平高于HEK293细胞;敲低DTX2表达可显著降低A498和Caki-1细胞的增殖、迁移及侵袭能力(均P<0.01)。结论:DTX2在ccRCC组织和细胞中呈高表达,其高表达患者的预后较差。敲低DTX2表达可抑制ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭,DTX2有望成为ccRCC新的生物标志物和治疗靶点。

siah E3泛素蛋白连接酶2对胰腺癌细胞增殖的影响及机制

目的检测siah E3泛素蛋白连接酶2(SIAH2)对胰腺癌细胞增殖的影响及探讨其机制。方法应用生物信息学分析胰腺癌与SIAH2的临床相关性。用免疫组织化学(IHC)染色检测癌组织与癌旁组织中SIAH2的表达量。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测胰腺癌细胞和正常胰腺导管细胞中基因的表达。用SIAH2的小干扰RNA(siRNA)感染PANC-1及SW1990胰腺癌细胞;5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EDU)和细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测SIAH2对胰腺癌细胞增殖的影响。组间比较采用t检验。结果生物信息学及IHC实验显示SIAH2在胰腺癌中表达升高(P<0.05)。SIAH2的表达与患者的总生存期和无病生存期呈负相关,与肿瘤分级、分期和T分期相关(P<0.05)。RT-qPCR及Western blot结果显示,正常胰腺导管细胞(HPDE)中SIAH2 mRNA及蛋白表达量低于胰腺癌细胞(BXPC-1、PANC-1、SW1990、MIA-PaCA-2、ASPC-1)(RT-qPCR:0.997±0.047比2.533±0.404比3.000±0.458比2.800±0.400比2.267±0.351比1.667±0.153,t=6.489、7.247、7.570、5.536、10.220,P<0.05;Western blot:1.000±0.027比1.740±0.187比2.213±0.474比2.242±0.328比1.734±0.209比1.898±0.189,t=7.697、4.672、7.139、6.219、7.925,P<0.05)。敲低SIAH2后胰腺癌细胞增殖能力降低。Western blot实验结果发现,siRNA组SMO、GLI1、PCNA表达低于NC组[SMO:PANC-1(0.999±0.019比0.473±0.010比0.412±0.017;t=92.380、34.670);SW1990(1.000±0.054比0.476±0.023比0.453±0.017;t=21.740、14.010);GLI1:PANC-1(0.999±0.014比0.484±0.040比0.514±0.039;t=2.817、2.790);SW1990(1.004±0.030比0.443±0.024比0.476±0.018,t=24.860、50.780);PCNA:PANC-1(0.999±0.007比0.390±0.030比0.390±0.079,t=24.240、13.790);SW1990(1.001±0.016比0.534±0.050比0.450±0.026,t=14.080、50.540,P<0.05)]。在回复实验中,敲低后的SIAH2加入SAG后,细胞增殖能力恢复,并且Western blot实验结果发现,si-SIAH2#1+SAG组SMO、GLI1、PCNA表达高于si-SIAH2#1组[SMO:PANC-1(0.974±0.018比0.466±0.012,t=36.200);SW1990(0.965±0.026比0.410±0.018,t=6.880);GLI1:PANC-1(1.005±0.023比0.464±0.042;t=20.850);SW1990(1.002±0.021比0.504±0.018,t=21.980);PCNA:PANC-1(0.956±0.036比0.501±0.015,t=16.580);SW1990(0.989±0.066比0.535±0.031,t=8.620,P<0.05)]。si-SIAH2#2+SAG组SMO、GLI1、PCNA表达高于si-SIAH2#2组[SMO:PANC-1(1.002±0.043比0.410±0.018,t=18.200);SW1990(1.000±0.015比0.415±0.023,t=49.400);GLI1:PANC-1(0.999±0.077比0.458±0.043,t=15.610);SW1990(0.974±0.030比0.527±0.037,t=26.350);PCNA:PANC-1(0.974±0.014比0.512±0.021,t=47.470);SW1990(1.000±0.035比0.535±0.053,t=14.320,P<0.05)]。结论SIAH2在胰腺癌组织及细胞中高表达及表达量与患者预后负相关,且SIAH2通过Hedgehog通路促进胰腺癌细胞增殖。

miR-126-5p通过靶向Peli2影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化发生

目的探讨微小RNA-126-5p(miR-126-5p)通过靶向pellino E3泛素蛋白连接酶家族成员2(Peli2)影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)发生的分子机制。方法本研究起止时间为2018年12月至2019年12月。体外培养人肾小管上皮细胞HK-2(美国ATCC),分别使用5 mmol/L、30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h,分别记作对照组、模型组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测miR-126-5p、Peli2的表达水平。利用脂质体转染法分别将miR-126-5p寡核苷酸模拟物(miR-126-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、Peli2小分子干扰RNA(si-Peli2)及其阴性对照(si-NC)转染至HK-2细胞,使用30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h。Western blot检测上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指蛋白(Snail)表达量;双荧光素酶报告实验验证miR-126-5p与Peli2的靶向关系。结果与对照组相比,模型组miR-126-5p[(1.00±0.10)比(0.32±0.03)]、E-Cadherin[(0.86±0.09)比(0.35±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05),Peli2[(0.42±0.04)比(1.05±0.11)]、N-Cadherin[(0.45±0.05)比(0.99±0.10)]、Vimentin[(0.32±0.03)比(0.92±0.09)]、Snail[(0.22±0.02)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05);转染miR-126-5p mimics,与转染miR-NC相比,E-Cadherin[(0.34±0.03)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.02±0.11)比(0.53±0.05)]、Vimentin[(0.95±0.10)比(0.48±0.05)]、Snail[(0.72±0.07)比(0.36±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);转染si-Peli2后,与转染si-NC相比,E-Cadherin[(0.24±0.03)比(0.70±0.07)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.05±0.12)比(0.50±0.05)]、Vimentin[(0.96±0.10)比(0.38±0.04)]、Snail[(0.74±0.07)比(0.40±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);miR-126-5p能够特异性结合Peli2,Peli2是miR-126-5p的靶基因;Peli2过表达后可明显逆转miR-126-5p过表达对高糖诱导的HK-2细胞EMT的影响。结论miR-126-5p通过靶向Peli2抑制糖尿病肾病肾小管上皮细胞EMT发生。

运用CRISPR-dCas9-VP64基因编辑技术验证microRNA-140的独立转录启动位点

目的探讨microRNA-140(miR-140)是否有独立于其宿主基因WWP2的转录启动子,从而为骨性关节炎的治疗提供新的思路。方法通过共转染CRISPR-dCas9-VP64和ACAN gRNA慢病毒的SW1353细胞验证软骨细胞特征性基因ACAN的转录水平。通过构建能稳定表达CRISPR-dCas9-VP64的SW1353细胞并结合多条sgRNA(single guide RNA,sgRNA/gRNA)、人类髋关节软骨RNA测序结果验证miR-140是否与WWP2基因共表达,是否有独立的转录启动位点。结果共转染CRISPR-dCas9-VP64和ACAN gRNA慢病毒的SW1353细胞能显著提高软骨细胞特征性基因ACAN的转录水平。从基因水平、蛋白水平证实成功构建能稳定表达CRISPR-dCas9-VP64的SW1353细胞。通过人类髋关节软骨RNA测序结果设计多条WWP2 gRNA以及miR-140启动子gRNA。实时定量PCR结果显示miR-140的表达既受其宿主基因WWP2调控,同时也有其独立的转录位点。结论运用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建稳定表达CRISPR-dCas9-VP64蛋白的SW1353细胞能极大减少实验中样本间的差异化,保证实验结果的一致性。结合多条gRNA证明了miR-140既与WWP2共表达,同时也受其独立的转录启动子调控转录。运用CRISPR-dCas9-VP64d-gRNA能单独调控miR-140的表达,同时其宿主基因的表达不受影响,有潜力作为新兴的基因治疗方法治疗骨性关节炎。

基因多态性与急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的关联研究

目的探讨含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)基因的2个单核苷酸多态性位点(rs3790088、rs4247109)与急性一氧化碳中毒后迟发性脑病(DEACMP)潜在的关联性,探寻引起DEACMP的遗传易感基因。方法选择2006年11月至2017年12月就诊的急性一氧化碳中毒(ACMP)昏迷抢救成功患者,共235例DEACMP患者和429例ACMP患者,ACMP患者均随访90 d以上且未发生DEACMP。采用血液基因组DNA提取试剂盒进行外周血DNA提取;运用Sequenom分型检测技术分析WWP2基因多态性与DEACMP的遗传易感性。DEACMP患者入院后每3 d评估一次《长谷川痴呆量表》(HDS)和《日常生活能力量表》(ADL),评估患者智力和生活能力受损程度。基因型分布是否符合Hardy-Weinderg平衡定律用拟合优度χ^2检验,两组患者基因关联性分析采用2×2四格表或2×3列联表χ^2检验,共显性遗传模式用2×3列联表χ^2检验。结果rs3790088位点包含226例DEACMP患者和414例ACMP患者,rs4247109位点包含234例DEACMP患者和428例ACMP患者。DEACMP和ACMP患者各基因型Hardy-Weinberg平衡检验差异无统计学意义(P>0.05)。DEACMP与ACMP患者rs3790088和rs4247109位点基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)。按性别分组后,DEACMP与ACMP患者rs3790088和rs4247109位点基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)。三种遗传模式(共显性遗传、显性遗传、隐性遗传)下rs3790088和rs4247109位点基因型与DEACMP发病无关联(P>0.05)。结论WWP2基因的2个单核苷酸多态性位点(rs3790088、rs4247109)和DEACMP的发病尚无法确定存在遗传相关性。

基于TGF-β/Smads信号通路探讨肾康注射液对输尿管结扎模型小鼠的作用

目的:通过观察肾康注射液对输尿管结扎(UUO)模型小鼠E3泛素连接酶Smurf2介导TGF-β/Smads信号通路的影响,探索其抗肾间质纤维化的作用机制。方法:将50只C57BL/6J小鼠随机分成5组,即假手术组、UUO模型组、肾康注射液高剂量组、肾康注射液中剂量组、肾康注射液低剂量组,每组10只。通过左侧输尿管结扎手术制备UUO动物模型,观察血清中肌酐和尿素氮、肾脏组织形态、Smurf2及TGF-β信号通路相关蛋白的表达情况。结果:肾康注射液可减轻UUO引起肾功能的异常,并可通过减少肾小管的扩张、胶原蛋白沉积和肾小管间质腔扩张来改善肾小管间质损伤和纤维化;此外,肾康注射液通过促进Smad7与E3泛素链接酶Smurf2的表达,使TGF-β1的Ⅰ型受体、P-Smad2/3泛素化降解。结论:肾康注射液可以通过泛素化的方式调节UUO模型小鼠中的TGF-β/Smad信号通路,减轻肾间质纤维化。

根皮苷对食管癌细胞系表达谱的影响

目的研究根皮苷对食管癌细胞系表达谱的影响,探索根皮苷作用于食管癌细胞系的信号通路及其潜在功能。方法使用根皮苷处理人食管癌KYSE450细胞,提取总RNA并建立测序文库,进行转录组测序;使用DESeq2程序鉴定差异表达基因,对差异表达基因进行基因本体(gene ontology,GO)功能及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析;使用MCODE进行差异基因核心模块筛选,使用GEPIA数据库分析核心模块中的基因对食管癌生存的影响;使用TIMER在线分析根皮苷对食管癌组织免疫细胞浸润的影响。结果转录组测序结果显示,根皮苷处理后的食管癌细胞具有4602个差异表达基因,其中2407个为上调基因,2195个为下调基因。通路富集分析显示,根皮苷对蛋白质加工、胰岛素抵抗、基因复制和细胞周期等信号通路产生影响。在差异表达基因核心模块中,E3泛素蛋白连接酶2(E3 ubiquitin ligase mind bomb 2,MIB2)高表达可降低食管癌患者的总体生存率;环指蛋白19B(ring finger protein19B,RNF19B)、三重基序蛋白69(tripartite motif-containing protein 69,TRIM69)、泛素连接酶(ubiquitin conjugating enzyme,UBC)和克隆E3泛素连接酶(homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 2,HECTD2)的表达水平可影响食管癌癌组织的纯度以及免疫细胞浸润的类型。结论根皮苷可影响食管癌细胞的转录谱,其差异表达基因主要集中在细胞生长相关的信号通路。