微小核糖核酸-1205沉默Cullin-RING泛素E3连接酶4A激活AMPK信号传导保护人成骨细胞免受地塞米松损伤的研究

目的:腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活可以抑制地塞米松(Dex)诱导的成骨细胞损伤。Cullin-RING泛素E3连接酶4A(CUL4A)决定了AMPKα泛素化和蛋白酶体降解。本研究鉴定了一种新型的靶向CUL4A的微小核糖核酸-1205(miR-1205)。方法:为了研究miR-1205对Dex诱导人类成骨细胞的氧化损伤和细胞死亡的影响,对hFOB1.19成骨细胞和原代人成骨细胞进行培养和分化,提取第3~10代的原始人类成骨细胞总细胞RNA,并通过反转录获得c DNA。利用qPCR、2ΔΔCt方法进行数据定量,分析miR-1205的表达。将生成表达premiR-1205的慢病毒(lv-premiR-1205)或miR-1205反义慢病毒(lv-antagomiR-1205),进行过滤并添加至h FOB1.19细胞或人成骨细胞。将细胞接种到六孔板中,通过miR模拟物转染,进行遗传修饰。检查CUL4A 3’-UTR荧光素酶的活性,并对结果进行量化。在对hFOB1.19细胞使用Dex处理后,对细胞功能包括细胞生存力测定,细胞死亡检测,以及通过核TUNEL染色和caspase-3活性测定及Western印迹测定进行细胞凋亡检查。结果:将CUL4A七个靶向miRNA模拟物中的每一个都分别转染到hFOB1.19成骨细胞中。其中,miR-1205模拟物导致最显著的CUL4A mRNA降低。miR-1205的亚细胞分布表明,内源性miR-1205的大部分位于细胞质中。生物素化的miR-1205与hFOB1.19细胞中的CUL4A m RNA直接关联并使其沉默,从而导致AMPK级联激活,并显著减弱h FOB1.19细胞中Dex诱导的细胞毒性。此外,miR-1205的过表达显著抑制了hFOB1.19细胞中Dex诱导的凋亡激活。结论:在h FOB1.19细胞和人类成骨细胞中,通过miR-1205沉默CUL4A,激活了AMPK信号传导,并调节其下游靶标发挥有效的抗氧化活性,极大减弱Dex诱导的细胞毒性,从而显著保护成骨细胞。

泛素E3连接酶CHIP和E4B互换U-box结构域突变体的构建及泛素化活性验证

旨在构建互换U-box结构域的泛素E3连接酶CHIP和E4B的突变体,用以研究U-box结构域对两种U-box家族泛素E3连接酶CHIP和E4B活性的影响。通过overlap PCR的方法构建CHIP U-box替换为E4B U-box的突变体C+E,以及E4B U-box替换为CHIP U-box的突变体E+C。将突变体质粒分别与CHIP底物RCC2、E4B底物NIPSNAP1、CHIP和E4B共同底物p53、CDC37质粒共转染至HEK-293T细胞。Western Blot检测底物和CHIP、E4B及其突变体表达情况,免疫共沉淀法检测底物的泛素化水平。结果显示,成功构建了两种泛素连接酶互换U-box结构域的突变体,且两种突变体在HEK-293T细胞中均能表达。两种突变体均部分保留了泛素化各自底物的活性,C+E能够泛素化共同底物p53和CDC37。

NEDD4L和ULK1在非小细胞肺癌中的表达及预后价值

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中NEDD4样E3泛素蛋白连接酶(NEDD4L)、UNC-51样激酶1(ULK1)的表达及临床意义。方法选取2017年1月—2018年1月三二〇一医院收治的88例NSCLC患者作为研究对象。应用R语言分析癌症基因组图谱(TCGA)数据库中NSCLC及癌旁组织中NEDD4L和ULK1 mRNA的表达差异,免疫组织化学法分析癌组织和癌旁组织中NEDD4L和ULK1蛋白的表达,Kaplan-Meier法分析NEDD4L、ULK1表达与患者生存预后的关系,单因素及多因素Cox回归分析影响NSCLC患者生存预后的危险因素。结果癌组织NEDD4L mRNA相对表达量低于癌旁组织(P<0.05),ULK1 mRNA相对表达量高于癌旁组织(P<0.05)。癌组织NEDD4L的阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05),ULK1的阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)。有无淋巴结转移、不同TNM分期患者的癌组织NEDD4L、ULK1阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,NSCLC患者癌组织中NEDD4L与ULK1的表达呈负相关(r_(s)=-0.587,P<0.05)。NEDD4L阴性表达患者3年总体生存率较阳性表达患者低(P<0.05),NEDD4L阳性表达患者平均生存时间较阴性表达患者长(P<0.05)。ULK1阳性表达患者3年总体生存率较阴性表达患者低(P<0.05),LK1阳性表达患者平均生存时间较阴性表达患者长(P<0.05)。单因素Cox回归分析结果显示,肿瘤TNM分期Ⅲ期[HR^(^)=1.898(95%CI:1.320,2.729)]、NEDD4L阴性表达[HR^(^)=1.654(95%CI:0.921,2.588)]和ULK1阳性表达[HR^(^)=1.692(95%CI:0.860,2.650)]是NSCLC患者预后的影响因素(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,NEDD4L阴性表达[HR^(^)=1.878(95%CI:0.961,2.995)]、ULK1阳性表达[HR^(^)=1.679(95%CI:0.785,2.884)]及肿瘤TNM分期Ⅲ期[HR^(^)=1.937(95%CI:1.131,3.317)]是NSCLC患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论NSCLC中NEDD4L表达降低,ULK1表达升高,NEDD4L、ULK1的表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关,NEDD4L阴性表达、ULK1阳性表达是NSCLC患者不良预后的独立危险因素。

CUL4B、TRPM2在胰腺癌组织中的表达和临床意义

目的探讨胰腺癌组织中E3泛素连接酶Cullin4B(CUL4B)、人瞬时受体电位M2(TRPM2)的表达及临床意义。方法收集2019年3月—2020年3月在西安交通大学医学院附属3201医院接受手术治疗胰腺癌患者86例的癌组织和癌旁组织。采用免疫组织化学检测组织中CUL4B、TRPM2蛋白表达。采用实时荧光定量PCR检测组织中CUL4B、TRPM2 mRNA水平。Spearman秩相关分析CUL4B与TRPM2蛋白表达的关系。Kaplan-Meier曲线分析CUL4B、TRPM2蛋白表达对患者预后的影响。Cox比例风险模型分析胰腺癌预后影响因素。结果胰腺癌组织中CUL4B、TRPM2蛋白阳性率及mRNA基因的相对表达量高于癌旁组织(χ^(2)/t=70.245、60.224、15.741、10.976,P均<0.001)。胰腺癌组织中CUL4B与TRPM2蛋白表达呈显著正相关(r=0.720,P<0.001)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移胰腺癌中CUL4B、TRPM2蛋白阳性率高于Ⅰ~ⅡA期、无淋巴结转移癌组织(χ^(2)=16.511、14.834,15.576、15.007,P均<0.001)。CUL4B阳性组和阴性组3年总生存率分别为9.68%(6/62)、41.67%(10/24),TRPM2阳性组和阴性组3年总生存率分别为8.33%(5/60)、42.31%(11/26),CUL4B阳性组、TRPM2阳性组患者3年累积生存率低于CUL4B阴性组、TRPM2阴性组患者(Log-Rankχ^(2)/P=9.933/0.002、11.102/0.001)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移、CUL4B阳性、TRPM2阳性是影响胰腺癌不良预后的独立危险因素[HR(95%CI)=1.781(1.199~2.646),1.962(1.172~3.285),2.482(1.445~4.263),1.733(1.223~2.457)]。结论胰腺癌组织中CUL4B、TRPM2表达升高,两者表达与胰腺癌不良临床病理特征有关,是胰腺癌预后相关肿瘤标志物。

CRL4在增殖的肝细胞系中上调乙型肝炎病毒抗原的分泌表达

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)编码的X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对HBV感染的启始和维持至关重要。HBx可能作为病毒来源的接头分子,介导Cullin-RING E3泛素连接酶4(CullinRING ubiquitin E3ligase 4,CRL4)复合物对染色体外DNA限制因子SMC5/6的降解。最近研究发现,CRL4接头分子DNA损伤结合蛋白1(DNA damage-binding protein 1,DDB1)可不依赖与HBx的相互作用而直接上调病毒的表达和复制。本研究基于HBx基因删除(X-null)的HBV重组共价闭合环状DNA(recombinant covalently closed circular DNA,rcccDNA)模型系统,在多种体外培养肝细胞系中证实上述发现。有意思的是,CRL4刺激rcccDNAX-null转染细胞抗原分泌表达的效应能被血清饥饿实验抵消。应用尾静脉高压注射小鼠模型,同样发现CRL4并不上调rcccDNAX-null在非增殖小鼠肝脏细胞中的表达。以上结果提示,细胞增殖特征与CRL4不依赖HBx上调病毒抗原分泌表达的效应密切相关,有助于HBx生物学意义的准确分析和理解。

SUMO化修饰与早幼粒白血病蛋白核体形成

早幼粒白血病蛋白核体(promyelocytic leukaemia nuclear bodies,PMLNBs)是哺乳动物细胞中普遍存在的一种亚核结构,广泛参与如转录调节、基因组稳定性维持、抗病毒、细胞凋亡、肿瘤抑制等一系列的生物学事件.SUMO(smallubiquitinmodifier)修饰是蛋白质翻译后修饰领域中的研究热点,SUMO修饰对PML核体的形成与降解都发挥着重要作用.近年来研究发现,人的E3泛素连接酶RNF4(RING finger protein4),可促进依赖SUMO-2/3修饰的PML核体的泛素化连接,并且ATO(三氧化二砷)可加速其对PML核体的降解.荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术可完全应用于活细胞内PML核体和SUMO蛋白之间在时间和空间上的精确互作.因此,更深入地研究PML核体形成和降解的机理以及在这个过程中重要蛋白质之间的相互作用具有重要而深远的意义.

基于蛋白质组学的慢性阻塞性肺疾病合并肺癌的关键靶点筛选与验证

目的 采用蛋白质组学分析联合生物信息学技术,初步预测慢性阻塞性肺疾病(COPD)相关肺癌(COPD-LC)的生物学机制及其潜在的核心治疗靶点,并进行验证。方法 收集2018年12月至2021年8月新疆医科大学第四临床医学院门诊就诊的COPD、肺癌患者以及体检的健康人员的尿液标本,并进行高通量测序。筛选差异蛋白并构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图,进行功能富集分析,进一步预测COPD-LC的关键靶点,最后采用基因表达数据库(GEO)对上述分子进行验证。结果 蛋白质组学结果显示,与正常对照组相比,COPD组存在157个差异蛋白,其中上调67个,下调90个;与正常对照组相比,肺癌组存在306个差异蛋白,其中上调132个,下调174个;此外,本研究基于相互作用基因检索工具(STRING)平台,将上述差异蛋白进行PPI分析。基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析结果显示,COPD-LC主要富集在细胞外区域、溶酶体、细胞外空间、淀粉酶活性、蛋白酶抑制剂活性、防御/免疫蛋白活性等方面。在GEO数据库中搜索关于COPD和肺癌患者微阵列数据,最终纳入GSE8581和GSE43346共2个数据集,在GSE8581数据集中共识别出13 605个差异基因,在GSE43346数据集中识别出3 403个差异基因,进一步分析GSE8581、GSE43346数据集与COPD-LC中差异基因的重叠程度,发现潜在转化生长因子β结合蛋白(LTBP)4、N-乙酰α-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、泛素蛋白连接酶E3成分N-识别蛋白4(UBR4)、DNA损伤结合蛋白1-CUL4相关因子(DCAF)5等4个重叠蛋白,最后在GEO数据集中获得验证。结论 本研究初步揭示了LTBP4、NAGLU、UBR4、DCAF5等4个COPD-LC的潜在治疗靶点,其中靶点NAGLU、UBR4、DCAF5在COPD和肺癌中鲜有报道。上述蛋白在COPD和肺癌中均显著低表达,或可成为COPD-LC的重要诊断与治疗的生物标志物。