E3泛素连接酶RNF144B负调控天然免疫的分子机制

RNA病毒的RNA聚合酶缺乏校正活性,使得其突变频率较高,针对其研发疫苗难度大。RLR信号通路是抵御RNA病毒的重要天然免疫信号通路。RLR通路中两个主要成员RIG-Ⅰ与MDA5在识别病毒核酸后,激活下游信号通路的传导,引起Ⅰ型干扰素和促炎性因子的表达。近期,中国农业科学院兰州兽医研究所卢曾军研究员领导的研究团队在EMBO Reports杂志上发表了题为“RNF144B negatively regulates antiviral immunity by targeting MDA5 for autophagic degradation”的研究论文,该研究发现了一个新的RLR通路负调控分子E3泛素连接酶RNF144B,揭示了它通过催化MDA5发生K27和K33泛素化促进其通过自噬途径降解的分子机制;丰富了对RLR信号通路调控机制的认识,为病毒性疾病和自身免疫疾病的防治提供了潜在的新靶点。

依托咪酯通过下调含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨依托咪酯(ETO)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)在其中发挥的作用机制。方法分别采用0、1、2和3 mg/L的ETO处理人正常肺上皮细胞系BESA-2B和人NSCLC细胞系A549,细胞计数试剂盒法检测细胞活力;将A549细胞随机分为对照组、ETO(3 mg/L)组、ETO+NC组和ETO+WWP2-OE组,后2组分别于ETO处理后转染空载体pcDNA3.1-NC或WWP2过表达载体pcDNA3.1-WWP2,集落形成试验检测细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中WWP2的mRNA表达;STITCH数据库选择与ETO直接相互作用的蛋白质;蛋白质印迹法检测各组细胞中WWP2、增殖、凋亡和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路相关蛋白表达。结果ETO以剂量依赖性方式显著降低A549细胞活力(F=147.923,P<0.001);而对正常肺上皮BESA-2B细胞活力无影响(F=1.427,P=0.126)。不同浓度(0、1、2、3 mg/L)ETO处理A549细胞后,集落形成数量逐渐减少[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(898±38)、(785±48)、(635±36)、(388±20)个],细胞凋亡率逐渐升高[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(2.23±0.65)%、(7.63±0.35)%、(13.24±0.47)%、(18.93±0.36)%],呈剂量依赖性(F=218.732、352.786,均P<0.001)。STITCH数据库预测ETO可通过上调WWP2蛋白表达和下调PTEN蛋白表达与WWP2和PTEN相互作用。与对照组相比,ETO组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达降低,集落形成数量减少,细胞凋亡率升高,增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞增殖抗原Ki67、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)和PTEN蛋白表达降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高,磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt(p-Akt)/Akt比值降低(均P<0.01);与ETO+NC组比较,ETO+WWP2-OE组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达升高,集落形成数量增多,细胞凋亡率降低,PCNA、Ki67、Bcl-2和PTEN蛋白表达增多,Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高(均P<0.01)。结论ETO可抑制A549细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控WWP2的下调和PTEN/PI3K/Akt通路的激活有关。

E3泛素连接酶RNF128在炎症和癌症中的作用和机制

泛素化是翻译后的一种修饰过程,参与调控蛋白质的降解以维持机体的内环境稳定。RNF128又名GRAIL,属于E3泛素连接酶的其中一员,是定位于内吞途径的Ⅰ型跨膜蛋白,与环状锌指蛋白结构具有同源性。RNF128含有PA和RING两个结构域,分别起识别和捕获靶蛋白(PA结构域)和对靶蛋白靶点进行泛素化(RING结构域)的功能。在机体中,RNF128参与调节T细胞、免疫耐受和细胞因子的产生等多个生理过程,是重要的免疫调节分子。因此,RNF128在炎症、肿瘤和代谢等免疫性疾病的发生发展过程中起着重要的作用,本文就RNF128在炎症和癌症中所起的作用和机制进行综述。

E3泛素连接酶RNF126调控舌癌细胞侵袭能力的分子机理研究

目的:在人E3泛素连接酶cDNA文库中筛选得到与舌癌发生相关的候选蛋白环指蛋白126(RNF126),利用体外实验进一步分析RNF126调控舌癌发生的分子机制。方法:分子克隆方法构建RNF126克隆和RNAi表达载体,MTT法检测RNF126对人舌癌细胞SCC25增殖的影响,细胞迁移实验分析人舌癌细胞迁移能力受RNF126的影响。结果:与对照组相比,RNF126明显促进SCC25细胞的增殖;抑制RNF126的表达后SCC25细胞的生长明显减缓。单个SCC25细胞形成克隆的能力在抑制RNF126后也受到明显的抑制。Transwell小孔实验证实SCC25细胞迁移能力随着RNF126表达的抑制而降低(P<0.05)。结论:体外实验结果提示RNF126与舌癌的侵袭有一定的关系。

川续断皂苷B抑制线粒体E3泛素连接酶1减轻缺血性中风大鼠脑损伤

目的探讨川续断皂苷B对缺血性脑卒中的作用及机制。方法SD大鼠和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞分别给予左脑缺血2 h、再灌注24 h和低氧8 h、复氧24 h的处理,在动物水平和离体水平建立缺血性脑卒中模型并给予不同剂量的川续断皂苷B。通过神经功能学评分、TTC染色、TUNEL染色检测大鼠脑损伤以及运用MTS法、LDH细胞毒性释放实验、流式细胞术等手段检测PC12细胞损伤,并运用Western印迹法对相关蛋白水平进行检测。运用MOE分子对接软件对川续断皂苷B和线粒体E3泛素连接酶1(Mul1)进行分子相互作用预测。结果与假手术组相比,模型组大鼠发生了严重脑损伤(神经功能学评分升高、脑梗死灶出现、TUNEL阳性细胞增多,胱天蛋白酶3活性增强、ATP产量减少),同时Mul1和动力相关蛋白1(Drp1)水平升高,mitofusin2(Mfn2)蛋白水平降低。川续断皂苷B能够减弱脑损伤并逆转Mul1,Drp1和Mfn2的蛋白水平改变。离体水平结果一致,与对照组相比,低氧处理的PC12细胞出现了细胞损伤(细胞PI阳性率从5%左右增加至35%左右、胱天蛋白酶3活性增强、LDH释放率增加)和线粒体功能下降(线粒体膜电位ΔΨm和ATP产量下降,ROS产量和线粒体分裂增加),同时Mul1和Drp1表达上调,Mfn2蛋白水平降低,以上现象能被川续断皂苷B抑制。MOE分子对接结果显示,川续断皂苷B可能和Mul1294位Asp、303位和320位Val和318位Gly存在相互作用。结论川续断皂苷B能够通过抑制Mul1改善线粒体功能保护大鼠脑组织免于缺血性损伤。

泛素E3连接酶CHIP和E4B互换U-box结构域突变体的构建及泛素化活性验证

旨在构建互换U-box结构域的泛素E3连接酶CHIP和E4B的突变体,用以研究U-box结构域对两种U-box家族泛素E3连接酶CHIP和E4B活性的影响。通过overlap PCR的方法构建CHIP U-box替换为E4B U-box的突变体C+E,以及E4B U-box替换为CHIP U-box的突变体E+C。将突变体质粒分别与CHIP底物RCC2、E4B底物NIPSNAP1、CHIP和E4B共同底物p53、CDC37质粒共转染至HEK-293T细胞。Western Blot检测底物和CHIP、E4B及其突变体表达情况,免疫共沉淀法检测底物的泛素化水平。结果显示,成功构建了两种泛素连接酶互换U-box结构域的突变体,且两种突变体在HEK-293T细胞中均能表达。两种突变体均部分保留了泛素化各自底物的活性,C+E能够泛素化共同底物p53和CDC37。

泛素E3连接酶对多发性骨髓瘤细胞增殖、克隆形成能力的影响

目的明确泛素E3连接酶(DTL)对多发性骨髓瘤细胞增殖、克隆形成的影响,并探讨其机制。方法提取34例多发性骨髓瘤患者骨髓中CD138+细胞后,以14例健康志愿者骨髓单个核细胞为对照,实时定量PCR检测DTL在mRNA水平的变化,并选取12例骨髓瘤患者和2例对照,Westernblot检测DTL在蛋白水平的变化。同时,人骨髓瘤细胞系RPMI8226分为对照(CON)与DTL敲低(DTL-shRNA)组,感染10感染复数CON与DTL-shRNA病毒48h,使用流式细胞仪确认慢病毒的感染效率、实时定量基因扩增荧光检测系统和Westernblot确认在mRNA和蛋白水平的敲低效率,使用细胞增殖及毒性检测试剂盒检测细胞在随后的0、24、48、72、96h的细胞数量变化,将CON与DTL-shRNA细胞培养于半固体培养基中,10d后倒置相差显微镜观察大于50个细胞的克隆数量,并使用膜联蛋白V/碘化丙啶双染法检测凋亡的变化,碘化丙啶染色检测细胞周期的变化。使用Westernblot检测核因子-κB(NF-κB)通路中P65和抑制因子κBα(IκBα)磷酸化水平的改变、凝胶迁移实验检测NF-κB转录活性的变化。结果健康志愿者骨髓单个核细胞与骨髓瘤患者CD138+细胞中,DTL的表达量分别为1.00±0.12和9.36±3.71(t=3.65,P=0.0024),DTL在骨髓瘤CD138+细胞中蛋白水平同样呈现过表达。RPMI8226感染CON与DTL-shRNA病毒48h后,绿色荧光蛋白阳性细胞的比率为90%,CON组与DTL-[JP2]shRNA组DTL在mRNA水平相对表达量分别为1.00±0.01和0.21±0.04(t=33.19,P<0.0001),在蛋白水平DTL的相对表达量分别为0.52±0.13和0.11±0.02(t=5.399,P=0.0057)。CCK8检测CON组与DTL-shRNA组细胞增殖后显示0、24、48、72、96h的细胞增殖倍数分别为1.00±0.03比1.00±0.02、2.19±0.28比1.47±0.13、3.50±0.14比2.24±0.19、5.43±0.41比3.08±0.14、7.42±0.17比4.29±013(F=24.58,P=0.001)。检测CON组与DTL-shRNA组的克隆形成后显示,DTL-shRNA组大于50个细胞的克隆不可见,CON与DTL-shRNA克隆形成数量分别为76±4比0(P<0.01),在细胞周期中,CON与DTL-shRNA组G1期细胞比例分别为(28.61±8.64)%比(57.25±10.37)%(t=3.675,P=0.0213),细胞凋亡中,CON与DTL-shRNA组膜联蛋白V+细胞比例为(3.21±0.89)%比(34.71±18.68)%(t=2.895,P=0.0443)。RPMI8226感染CON与DTL-shRNA慢病毒48h后,CON与DTL-shRNA磷酸化P65相对表达量分别为1.52±0.14和0.82±0.11(t=6.81,P=0.0024),而P65的表达分别为0.25±0.04和0.24±0.08(t=0.19,P=0.85),差异无统计学意义,CON与DTL-shRNA磷酸化IκBα的相对表达量分别为0.19±0.03和0.13±0.02(t=2.882,P=0.0449),而IκBα相对表达量分别为0.22±0.05和1.01±0.06(t=17.52,P<0.0001)。凝胶迁移实验检测DTL-shRNANF-κB转录活性进一步确定了DTL的下调抑制了NF-κB转录活性。结论DTL在多发性骨髓瘤细胞中高表达,且DTL的下调抑制了细胞增殖,阻断了克隆形成,促进细胞凋亡和细胞周期阻滞,而DTL对骨髓瘤细胞生物学功能的影响与NF-κB通路的改变相关。

RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活

目的利用慢病毒干涉下调内源性RNF31表达,研究NF-κB通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人RNF31的shRNA片段克隆到慢病毒表达载体p Green Puro中,瞬时转染HEK293T细胞,筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装质粒PMD、SPA共转染293T细胞,在24 h、48 h分2次收集慢病毒上清,用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染HEK293细胞,提取细胞蛋白,Real-time PCR以及Western Blot检测RNF31干涉效果;报告基因实验检测敲低RNF31对NF-κB转录活性的影响;Real-time PCR检测干涉RNF31对TNF-α诱导的NF-κB下游靶基因的影响;Western Blot检测下调RNF31对IκBα活化的影响;Hochest染色检测下调RNF31对细胞凋亡的影响。结果成功构建RNF31干涉慢病毒p Green Puro-RNF31载体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度可达3×107pfu/ml。在HEK293细胞中下调RNF31,抑制TNF-α刺激的NF-κB的转录活性,并抑制NF-κB下游靶基因的表达;下调RNF31抑制TNF-α刺激的IκBα的活化;此外,在TNF-α刺激细胞24 h时,RNF31表达下调使细胞凋亡增多。结论 RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活。

小鼠睾丸组织特异表达基因Rnf148的鉴定及其编码E3泛素连接酶的功能分析

目的研究小鼠Rnf148基因表达的时空特异性及其环指结构域的E3泛素连接酶功能。方法提取不同成年小鼠组织、不同胚胎期组织和出生后小鼠睾丸组织的总RNA,通过实时荧光RT-PCR和Northern杂交分析小鼠Rnf148基因的表达谱。构建包含整个Rnf148蛋白的环指结构域与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白原核表达载体,在BL21细菌中诱导表达后,经GST琼脂糖凝胶纯化GST-Rnf148重组蛋白。体外泛素化反应试验检测GST-Rnf148重组蛋白的E3泛素连接酶功能。结果在小鼠13种不同器官组织中,Rnf148mRNA仅存在于睾丸组织中。进一步Northern杂交验证了只在小鼠睾丸组织表达一个1.2kb左右的Rnf148基因mRNA片段。小鼠Rnf148基因在胚胎期及出生后3周内不表达,出生后21d开始表达,25d后达到表达高峰并一直持续表达。实验成功诱导表达并纯化了GST-Rnf148重组蛋白,体外蛋白泛素化反应显示该重组蛋白具有E3泛素连接酶的功能。结论小鼠Rnf148基因特异地表达在出生3周后的睾丸组织中,Rnf148蛋白的环指结构域具有泛素连接酶活性。

非小细胞肺癌中过表达RNF146对Axin和β-catenin表达和定位的影响

目的:观察E3泛素连接酶RNF146表达对Axin和β-catenin蛋白表达的影响,探讨RNF146与Wnt/β-catenin信号通路在非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展中的作用。方法:应用免疫组织化学EnVision法检测133例NSCLC患者肺癌中RNF146、Axin和β-catenin的表达。构建RNF146过表达质粒,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和细胞免疫荧光方法研究RNF146在肺癌细胞株A549和LTE中过表达对Axin和β-catenin表达及定位的影响。结果:NSCLC患者肺癌组织中RNF146高表达72例(54.1%)中49例(68.1%)显示Axin表达减弱或缺失,19例(26.4%)出现β-catenin细胞核阳性表达;RNF146低表达61例(45.9%)中只有26例(42.6%)显示Axin表达减弱或缺失,7(11.5%)例出现β-catenin细胞核阳性。RNF146与Axin的表达呈明显的负相关(P=0.003),与β-catenin的细胞核表达呈正相关(P=0.047)。肺癌细胞系中过表达RNF146能够下调Axin蛋白的表达,诱导β-catenin蛋白表达和核内分布,但对Axin和β-catenin mRNA水平没有影响。结论:RNF146可能通过Wnt/β-catenin通路参与肺癌的发生发展。

H9N2亚型流感病毒感染过程中神经介素B及受体对NF-κB信号通路泛素酶的调控

神经介素B(neuromedin B,NMB)及受体(NMB receptor,NMBR)通过NF-κB信号通路参与抑制甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)H1N1亚型(IAV/H1N1)的感染。但关于NMB和NMBR对NF-κB信号通路相关泛素蛋白酶的调控如何,尚未见报道。为探究NMB和NMBR调控IAV诱导的NF-κB信号通路相关的泛素蛋白酶表达的影响,本研究基于IAV/H9N2感染sh-NMBR细胞与NMB刺激的A549细胞,采用RT-PCR、qRT-PCR及Western blot(WB)分析NMB和NMBR对H9N2感染引起的NF-κB信号通路相关的E3泛素连接酶Mind bomb-2(MIB2)和Ring Finger Protein 8(RNF8)及去泛素蛋白酶Cylindromatosis(CYLD)的表达变化。结果显示:H9N2感染sh-NMBR细胞中,RNF8和CYLD表达增加,MIB2表达和P65磷酸化水平降低;NMB激活A549细胞中NMBR的表达后,诱导细胞中RNF8和CYLD的表达水平下降,MIB2表达和P65磷酸化水平增加。结果表明:NMB和NMBR通过调控IAV/H9N2感染诱导的泛素蛋白酶的表达和P65活性,从而影响IAV/H9N2感染激活的NF-κB信号通路的功能,该结果为深入研究NMB和NMBR抑制甲型流感病毒感染的作用机制提供了理论基础。

PHR1与新生儿神经系统CVB3感染的研究进展

脑、脊髓与血管之间的血脑屏障,有效阻止了毒素和病原体的入侵,对保护神经组织稳定的内环境极其重要。但是,室周器、穹窿下器官、连合下器、终板血管器和松果体等位于中枢神经系统的脑边缘系统主要由特化的室管膜细胞组成,大多具有丰富的毛细血管丛却缺乏血脑屏障,该部位与柯萨基病毒B3(CVB3)侵袭儿童尤其新生儿大脑引起脑膜炎部位具有一致性。尽管CVB3感染引起的脑膜炎很常见,然而引发的脑炎却很少。E3泛素连接酶PHR1高表达于脑边缘系统,可能直接或间接地与CVB3相互作用从而减弱、阻挡或消除CVB3对中枢神经系统的进一步感染和损伤,从而减少了新生儿脑炎的发病率。研究PHR1与CVB3-VP1之间的关系可能为预防和治疗CVB3病毒感染性中枢神经系统疾病提供新的药物治疗靶标。

E3泛素连接酶RNF216调控Th1型免疫应答促进肿瘤发生的研究

泛素-蛋白酶体蛋白降解系统是细胞内调控蛋白更新的重要机制,E3泛素连接酶是介导蛋白泛素化修饰的关键分子,可参与调控包括肿瘤发生的多种病理生理过程。E3泛素连接酶RNF216是否可调控肿瘤的发生发展尚不明确。本研究采用WT和RNF216基因缺陷型(RNF216-/-)小鼠,使用EO771乳腺癌细胞建立乳腺癌移植瘤模型,观察乳腺癌细胞在小鼠中的成瘤情况,以明确RNF216在肿瘤发生中的作用及其可能机制。实验结果表明乳腺癌细胞EO771在RNF216-/-小鼠中的成瘤情况和WT小鼠相比显著减小,而且存活率明显升高;腹腔注射CpG可抑制肿瘤的生长,在RNF216-/-小鼠中的抑瘤效果则显著增强。进一步研究表明在乳腺癌细胞EO771移植瘤小鼠模型中,和WT小鼠相比,CpG刺激RNF216-/-小鼠可显著诱导TNF-α、IFN-γ、IL-6等Th1型细胞因子的分泌,而Th2型细胞因子的变化不显著,这提示RNF216可能直接或者间接参与Th1型应答调控。可见,RNF216可通过调控Th1型免疫应答参与肿瘤的发生发展。

CUL4B、TRPM2在胰腺癌组织中的表达和临床意义

目的探讨胰腺癌组织中E3泛素连接酶Cullin4B(CUL4B)、人瞬时受体电位M2(TRPM2)的表达及临床意义。方法收集2019年3月—2020年3月在西安交通大学医学院附属3201医院接受手术治疗胰腺癌患者86例的癌组织和癌旁组织。采用免疫组织化学检测组织中CUL4B、TRPM2蛋白表达。采用实时荧光定量PCR检测组织中CUL4B、TRPM2 mRNA水平。Spearman秩相关分析CUL4B与TRPM2蛋白表达的关系。Kaplan-Meier曲线分析CUL4B、TRPM2蛋白表达对患者预后的影响。Cox比例风险模型分析胰腺癌预后影响因素。结果胰腺癌组织中CUL4B、TRPM2蛋白阳性率及mRNA基因的相对表达量高于癌旁组织(χ^(2)/t=70.245、60.224、15.741、10.976,P均<0.001)。胰腺癌组织中CUL4B与TRPM2蛋白表达呈显著正相关(r=0.720,P<0.001)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移胰腺癌中CUL4B、TRPM2蛋白阳性率高于Ⅰ~ⅡA期、无淋巴结转移癌组织(χ^(2)=16.511、14.834,15.576、15.007,P均<0.001)。CUL4B阳性组和阴性组3年总生存率分别为9.68%(6/62)、41.67%(10/24),TRPM2阳性组和阴性组3年总生存率分别为8.33%(5/60)、42.31%(11/26),CUL4B阳性组、TRPM2阳性组患者3年累积生存率低于CUL4B阴性组、TRPM2阴性组患者(Log-Rankχ^(2)/P=9.933/0.002、11.102/0.001)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移、CUL4B阳性、TRPM2阳性是影响胰腺癌不良预后的独立危险因素[HR(95%CI)=1.781(1.199~2.646),1.962(1.172~3.285),2.482(1.445~4.263),1.733(1.223~2.457)]。结论胰腺癌组织中CUL4B、TRPM2表达升高,两者表达与胰腺癌不良临床病理特征有关,是胰腺癌预后相关肿瘤标志物。

菊花B病毒外壳蛋白互作蛋白的筛选

采用PCR扩增菊花B病毒(CVB)外壳蛋白基因的开放阅读框,构建酵母双杂交系统所需的诱饵表达载体pGBKT7-CVBCP,测序验证后转化Y2HGold酵母菌。将酵母菌Y187/pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7-CVBCP进行交配转化,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上筛选蓝色阳性克隆并测序pGADT7-cDNA的插入片段。结果表明:诱饵载体表达产物对酵母无毒性作用,且对报告基因无自激活作用。筛选菊花cDNA文库初步得到了与CVB外壳蛋白相互作用的E3泛素连接酶ARIADNE-like蛋白和ATP结合蛋白,为进一步研究CVB外壳蛋白与寄主的互作机制奠定了基础。

环指蛋白1B与肿瘤的研究进展

多梳家族蛋白(PcG)参与多种细胞生命活动,包括细胞周期调控、癌变、老化、X染色体失活、决定细胞结局及干细胞分化,是一类染色质水平上通过表观遗传修饰调控靶基因的转录因子。环指蛋白1B(RNF2)作为PcG的重要成员,具有环指结构域,凭借其E3连接酶的特性可催化组蛋白2A(H2A)119位赖氨酸单泛素化,从而通过压缩染色质造成基因沉默并抑制转录延长阶段的进行,在干细胞增殖分化、维持干细胞自我更新能力中发挥重要作用。而且有研究发现RNF2与多种肿瘤的发生、发展、预后相关,有可能成为判断预后的生物标志物和潜在的治疗靶标。

miR-10b靶向PARK2调控乳腺癌对PD1抑制剂的敏感性

目的:探讨mi R-10b靶向结合E3泛素蛋白连接酶(PARK2)对乳腺癌细胞应用程序性死亡蛋白1(PD1)抑制剂敏感性的影响。方法:回顾性收集联勤保障部队第九〇九医院2010年1月—2015年12月收治的146例乳腺癌患者的病例资料。PCR实验分析癌组织和癌旁组织中mi R-10b相对表达量;根据癌组织中mi R-10b表达水平中位数将146例乳腺癌患者分为mi R-10b高表达组和mi R-10b低表达组,绘制Kaplan-Meier生存曲线,分析癌组织中mi R-10b表达水平与患者预后相关性;荧光素酶实验分析mi R-10b与PARK2的关系,Person线性回归分析癌组织中mi R-10b表达水平与PARK2表达水平相关性;根据癌组织中PARK2表达水平中位数将146例乳腺癌患者分为PARK2高表达组和PARK2低表达组,Western blot方法分析PARK2低表达组与PD1蛋白水平性相关性;培养人乳腺癌细胞系,转染mi R-10b mimic(模拟物)使细胞中PARK2处于低表达,再通过转染mi R-10b mimic(模拟物)和mi R-10b inhibitor(抑制物)将细胞分为PARK2低表达+mi R-10b mimics组和PARK2低表达+mi R-10b inhibitor组,MTT法分析调控mi R-10b表达水平对乳腺癌细胞增殖能力和对PD1抑制剂敏感性的影响。结果:mi R-10b在乳腺癌组织中表达水平高于对应的癌旁组织(1.61±0.77比1.35±0.98,P<0.01);乳腺癌组织中mi R-10b高表达提示预后不良(P<0.01);mi R-10b靶向结合PARK2,乳腺癌组织中mi R-10b表达量与PARK2表达量呈负相关(r=-0.419,P<0.01);PARK2低表达组中PD1蛋白质表达较PARK2高表达组上调(灰度比值1.44±0.79比1.05±0.98,P<0.01);mi R-10b高表达使乳腺癌细胞系增殖能力上调(P<0.01),对PD1抑制剂敏感性下调(P<0.01)。结论:高表达mi R-10b提示乳腺癌预后不良,并降低对PD1抑制剂敏感性,机制可能与PARK2信号通路相关。

miR-27b调控PINK1/parkin通路参与大鼠癫痫发作的机制

目的探究微小RNA 27b(miR-27b)调控PTEN诱导性激酶蛋白1(PINK1)/E3泛素连接酶(parkin)通路参与大鼠癫痫发作的机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、模型组、miR-27b NC组、miR-27b拮抗剂组、miR-27b拮抗剂+H89(PINK1上游因子PKA抑制剂)组,每组12只。除对照组外,其他组大鼠均构建癫痫大鼠模型。实验结束后观察大鼠行为学变化。qRT-PCR检测miR-27b表达。HE染色观察大鼠海马组织病理学变化。透射电镜观察海马CA1区线粒体超微结构。免疫组化法检测DRP1蛋白表达情况。Western blot检测各组海马组织中PINK1/parkin通路及自噬相关蛋白表达情况。结果与对照组相比,模型组和miR-27b NC组大鼠精神萎靡、饮食不佳、体形消瘦、皮毛光泽暗淡脏乱,神经细胞、线粒体损伤严重。与模型组相比,miR-27b拮抗剂组大鼠精神、饮食、皮毛状态、神经细胞及线粒体损伤程度有所改善。与miR-27b拮抗剂组相比,miR-27b拮抗剂+H89组大鼠精神、饮食、皮毛状态不佳、神经细胞及线粒体损伤程度加重。与对照组相比,模型组miR-27b表达水平、DRP1阳性细胞数显著增加,而PINK1、parkin、Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平显著降低(均P<0.05)。与模型组相比,miR-27b拮抗剂组发作次数、miR-27b表达水平、DRP1阳性细胞数显著降低,而发作潜伏期、PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平显著增加(P<0.05)。与miR-27b拮抗剂组相比,miR-27b拮抗剂+H89组发作次数、DRP1阳性细胞数显著增加,而发作潜伏期、PINK1、parkin、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平显著降低(均P<0.05)。结论miR-27b表达沉默可通过促进PINK1/parkin信号通路改善大鼠癫痫程度。

SUMO化修饰与早幼粒白血病蛋白核体形成

早幼粒白血病蛋白核体(promyelocytic leukaemia nuclear bodies,PMLNBs)是哺乳动物细胞中普遍存在的一种亚核结构,广泛参与如转录调节、基因组稳定性维持、抗病毒、细胞凋亡、肿瘤抑制等一系列的生物学事件.SUMO(smallubiquitinmodifier)修饰是蛋白质翻译后修饰领域中的研究热点,SUMO修饰对PML核体的形成与降解都发挥着重要作用.近年来研究发现,人的E3泛素连接酶RNF4(RING finger protein4),可促进依赖SUMO-2/3修饰的PML核体的泛素化连接,并且ATO(三氧化二砷)可加速其对PML核体的降解.荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术可完全应用于活细胞内PML核体和SUMO蛋白之间在时间和空间上的精确互作.因此,更深入地研究PML核体形成和降解的机理以及在这个过程中重要蛋白质之间的相互作用具有重要而深远的意义.

shRNA沉默环指蛋白146基因对非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭及其相关蛋白表达的影响

目的:shRNA沉默环指蛋白146(RNF146)基因,观察非小细胞肺癌细胞中RNF146沉默对肺癌细胞迁移和侵袭及其相关蛋白表达的影响。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法用于筛选RNF146高表达肺癌细胞系。构建shRNA-RNF146真核表达载体,瞬时转染A549和H1299肺癌细胞,Western blot检测转染效率。划痕实验评价肺癌细胞体外迁移能力;Buyden小室实验检测肺癌细胞体外侵袭能力。Western blot检测肺癌细胞中迁移和侵袭相关蛋白的表达。结果:RT-PCR和Western blot方法筛选RNF146高表达肺癌细胞系,显示A549和H1299细胞中RNF146蛋白均高于其它细胞系。shRNA-RNF146转染A549和H1299细胞系后,划痕实验显示转染组细胞24小时迁移率明显低于空载体组和未转染组(P<0.01)。Buyden小室实验结果表明转染组比空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少(P<0.05)。Western blot检测与细胞迁移和侵袭相关的调控蛋白(MMP2、MMP7、MMP9、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等)的表达情况,结果显示干扰RNF146后A549细胞中MMP2和MMP7表达明显减少,而MMP9、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表达变化不明显。结论:RNF146可能通过调控MMP2和MMP7的蛋白水平促进肺癌细胞迁移和侵袭。