胡杨Ring finger E3连接酶PeRH2提高烟草耐旱机制研究

近期研究表明泛素化在植物胁迫响应中扮演一个关键的角色。作为泛素-蛋白酶体系统(UPS)中的关键酶,泛素E3连接酶更是在细胞的新陈代谢中起着重要的作用。本文从胡杨中克隆了一个C端含有Ring finger结构域的蛋白(152个氨基酸)编码基因(Pe RH2),经过序列比对推断该基因编码产物为泛素E3连接酶,属于Ring finger家族中的Ring-H2构型。研究显示,甘露醇胡杨苗木在255 mmol/L甘露醇胁迫下,叶片Pe RH2表达量上调。拟南芥原生质体中瞬时表达融合质粒p Yellow0029-Pe RH2的研究表明,Pe RH2蛋白定位于细胞核。以农杆菌介导法将Pe RH2转入烟草,Sq RT-PCR结果显示,Pe RH2在转基因烟草中获得过表达。在255 mmol/L甘露醇处理下,转基因烟草幼苗耐受渗透胁迫的能力高于野生型和转空载体烟草。干旱处理后,转基因烟草的叶片保水力明显高于野生型和转空载体烟草,而叶片相对电导率、MDA的含量也要低于野生型和转空载体烟草。因此,过表达Pe RH2能够提高烟草的抗旱能力。

泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2高表达与胃癌临床分期、侵袭性及预后的相关性

目的研究泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2(MARCH2)高表达与胃癌分期、侵袭及预后之间的关系。方法将96例行胃癌根治术的胃癌患者纳为研究对象,免疫组织化学法检测患者胃癌组织及癌旁组织内MARCH2表达情况,分析MARCH2阳性表达与患者临床病理特征之间的关系。术后随访5~47个月,采用Kaplan-Meier法分析胃癌组织内MARCH2表达情况与患者生存时间的关系。结果胃癌组织内MARCH2阳性表达率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织内MARCH2阳性表达与胃癌浸润深度以及淋巴结转移有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期以及分化程度无关(P>0.05)。将胃癌组织内MARCH2中、强阳性表达者纳为MARCH2强阳性表达组,其余患者纳为对照组,随访5~47个月,平均(34.51±6.16)个月,绘制生存曲线发现,强阳性组患者生存时间短于对照组,差异具有统计学意义(Rank=8.923,P=0.003)。结论胃癌组织内MARCH2阳性表达率明显上升,且MARCH2阳性表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移间存在密切联系,MARCH2高表达者预后生存时间更短,提示MARCH2可能参与胃癌的发生及发展。

拟南芥中RING型E3泛素连接酶基因AtGW2的克隆和功能分析

水稻R ING型E3泛素连接酶基因O sGW2在调控水稻产量性状方面起着十分重要的作用。根据O sGW2的cDNA序列,通过RT-PCR方法从拟南芥中克隆了一个与O sGW2同源的基因,命名为AtGW2。序列分析表明,该基因编码一个R ING-C2型E3泛素连接酶蛋白,含有401个氨基酸。通过构建AtGW2RNA干扰植物表达载体并转化拟南芥,结果表明,获得的转基因后代植株的子粒较野生型大,并且转基因拟南芥子粒千粒重高于野生型,这表明AtGW2负调控拟南芥子粒大小及粒重。

玉米E3泛素连接酶类基因ZmGW2-1的克隆及表达分析

提高玉米产量是玉米育种的重要目标,而籽粒大小和粒重是禾谷类作物产量的重要构成因子。本研究根据水稻中已克隆的决定籽粒产量的主效基因Os GW2(RING型E3泛素连接酶)的序列信息,利用3’-RACE和RT-PCR技术从玉米基因组中分离出其直系同源基因,并对克隆的目的基因进行序列及组织表达特异性分析。结果表明,克隆得到的玉米同源基因编码区长为1287 bp,编码428个氨基酸残基。Blastx功能分析发现该基因编码E3泛素连接酶类蛋白,该基因的编码序列与Os GW2的编码序列相似度高达83%,将其暂时命名为ZmGW2-1,且ZmGW2-1在雌穗中高度表达,表明该基因可能参与玉米雌穗的发育调控。该基因的克隆为进一步分析其功能奠定了基础。

E3泛素连接酶HECW2在胃腺癌组织中的表达及其临床意义

目的:采用生物信息学方法分析E3泛素连接酶(HECW2)在胃腺癌组织中的表达及其临床意义,为寻找胃腺癌诊断和预后生物标志物提供新的线索。方法:用R语言分析HECW2在泛癌中的表达及其与泛癌预后的关系。借助UCSC Xena、HPA、Kaplan-Meier Plotter等数据库分析HECW2在胃腺癌组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系。采用WB法检测中国人胃腺癌组织及其癌旁组织中HECW2蛋白水平以验证数据库中的分析结果。借助TIMER和Cibersort数据库分析HECW2与胃腺癌免疫浸润的关系。通过LinkedOmics数据库对胃腺癌中HECW2进行GO功能分析和KEGG信号通路富集分析及相关性基因分析。结果:生物信息学分析结果表明,33种不同类型肿瘤中,包括胃腺癌在内的12种肿瘤中HECW2呈显著高表达(均P<0.05),WB法结果显示,中国人胃腺癌组织中HECW2也呈显著高表达(P<0.05)。HECW2表达水平越高,胃腺癌患者OS越短,包括CD4~+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞在内的免疫细胞浸润丰度越高(均P<0.01)。此外,HECW2相关信号通路主要富集于细胞外基质受体相互作用、黏着斑、细胞黏附和氧化磷酸化等生理病理过程(均P<0.01)。结论:HECW2在胃腺癌组织中呈显著高表达且其与胃腺癌预后不良和免疫细胞浸润密切相关,有成为胃腺癌预后标志物和治疗靶点的潜力。

小麦E3泛素连接酶基因TaAIRP2-1B克隆及功能分析

干旱等非生物胁迫严重影响农作物生产。本研究克隆了小麦(Triticum aestivum L.)TaAIRP2-1B基因,探讨其对非生物胁迫的响应机制,为促进小麦抗旱性的遗传改良提供基因资源。组织特异性表达模式分析显示,TaAIRP2-1B基因在小麦抽穗期的各个组织中均有表达,在茎组织中的表达水平较高,而根系中的表达水平较低。非生物胁迫表达模式分析显示,Ta AIRP2-1B受ABA、PEG及冷胁迫诱导表达。过表达TaAIRP2-1B拟南芥在0.4μmol/L的ABA处理条件下,种子发芽率显著低于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥种子萌发期对ABA的敏感性。ABA处理抑制转基因和野生型拟南芥幼苗的根系生长,但转基因拟南芥受抑制程度显著高于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥幼苗对ABA的敏感性。转基因结果表明超表达TaAIRP2-1B增强了拟南芥的抗旱性,并且转基因株系的保水率显著高于野生型。总之,本研究发现小麦基因Ta AIRP2-1B参与了植物对非生物胁迫的应答,可能是通过ABA途径正向调控植物的抗旱性。

E3泛素连接酶1对SOX2蛋白稳定性的影响

目的探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响。方法通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响。通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶。结果在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显。在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用。溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低。放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05)。WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰。结论WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达。

E3泛素连接酶WWP2通过蛋白酶体途径调控p21的稳定性

目的 探讨含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2 (WWP2)调控p21稳定性的潜在作用机制。方法 通过免疫共沉淀及Western blotting检测HEK 293T细胞中WWP2与p21的结合情况。用蛋白酶体抑制剂(MG132)和放线菌酮(CHX)处理过表达或敲减WWP2 HEK 293T细胞0、4、8 h,通过Western blotting检测p21的表达情况。结果 WWP2与p21间存在结合。过表达WWP2的293T细胞中,p21的表达水平明显降低,且随WWP2表达量增加逐渐降低。敲减WWP2的293T细胞中,p21表达水平增加。随着CHX作用时间延长,对照组和实验组的p21表达水平均逐渐下降。过表达组p21半衰期较对照组缩短;敲减组p21半衰期较对照组延长。随着MG132作用时间延长,对照组和实验组p21表达水平均逐渐上升。空载组较过表达组、敲减组较对照组p21积累均更显著。结论 E3泛素连接酶WWP2可与p21结合,并通过蛋白酶体途径降解p21。

E3泛素连接酶PARK2对人脑胶质瘤细胞侵袭与迁移能力的影响

目的探讨E3泛素连接酶PARK2影响脑胶质瘤细胞侵袭和迁移作用。方法采用免疫印迹法检测PARK2蛋白在脑胶质瘤细胞系中的表达情况;选用逆转录病毒载体p BABE-puro vector构建PARK2-WT(野生型)的稳定过表达细胞系;采用细胞划痕实验观察过表达PARK2后U251细胞迁移能力的变化;Transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力的变化;Real-time PCR检测MMP1、MMP12和MMP13基因表达水平。结果筛选脑胶质瘤细胞中PARK2蛋白表达水平,U251和T98G蛋白表达水平较低,并构建U251和T98G细胞上PARK2过表达株;脑胶质瘤细胞中PARK2过表达后,细胞迁移能力显著降低(P<0.01);U251和T98G细胞中PARK2过表达组相较于转染空载体的对照组穿过Matrigel基质胶及滤膜的细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。结论过表达PARK2可以抑制脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。

向日葵E3泛素连接酶基因的分析定位和表达鉴定

该研究利用前期获得的向日葵耐盐相关基因E3泛素连接酶基因序列(HERC2),构建瞬时表达载体Cam-35S-HERC2-GFP,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位;采用RT-PCR技术,分析盐胁迫下HERC2在耐盐品种P50和盐敏感品种P29根、下胚轴和叶中的表达差异;构建HERC2植物表达载体pPZP221-HERC2,采用农杆菌介导法将HERC2导入烟草,进行耐盐功能验证。结果表明:(1)HERC2蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(2)受到NaCl胁迫后,HERC2基因在耐盐品种P50和盐敏感品种P29中均上调表达,但耐盐品种中的表达量较高。(3)HERC2基因的表达,能够提高转基因烟草的耐盐性。该研究结果为进一步解析向日葵对盐胁迫的响应机制,以及耐盐新品种的选育奠定了基础。

HECW2基因与肿瘤的研究进展

含HECT,C2和WW域E3泛素蛋白连接酶2(HECW2)基因通过调节蛋白质的泛素化和降解过程参与细胞周期调控、信号转导以及细胞死亡等关键的生物学过程。既往有关HECW2基因的研究多聚焦于神经发育障碍与智力障碍等非肿瘤方面,而关于其在肿瘤发生发展中的作用机制的报道较少。近年研究认为HECW2基因在多种肿瘤类型中异常表达,并在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程中发挥重要功能,可影响肿瘤的生物学行为,这为后续探索肿瘤的分子机制提供了新的视角,为肿瘤的个性化靶向治疗奠定了前期基础。

Parkin:一种作用极其广泛的E3泛素连接酶

Parkin,又名PARK2,自发现初始便与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)密切相关。Parkin被认为是一种神经保护性基因。随着对其结构的深入了解,揭开了作为E3泛素连接酶的面纱。Parkin参与调控细胞周期、线粒体动态平衡和能量代谢等细胞进程,并与许多疾病息息相关,甚至在同一通路中发挥完全相反的作用,即细胞增殖和凋亡,表明这必是一个作用极其广泛且重要的基因。本文概述了Parkin的发现和结构及其自身抑制的特点,重点阐述其作为E3泛素连接酶参与的泛素化过程和进而引起的自噬、降解蛋白质、改变蛋白质亚细胞定位和蛋白质间互作等。这些或许都作为Parkin预防PD和抑制肿瘤的基础。在此基础上,总结了Parkin异常导致PD的两方面原因:蛋白质质量控制异常和线粒体功能障碍,并延展了Parkin异常致使线粒体功能障碍所引起的心血管及肾的疾病;Parkin与癌症的内在联系也从Parkin作为一种肿瘤抑制因子、调控细胞周期、细胞凋亡及转移、氧化应激及能量代谢等方面展开了介绍。并对其研究进行了展望,通过保持Parkin的活性状态或增强其表达,可能达到改善PD病人病情的目的。但Parkin抑制肿瘤生长的机制仍尚待破译,且要加强Parkin在介导PD与癌症风险间关系的潜在作用的研究。这些后续的深入研究为在相关疾病的诊断与治疗中作为靶标分子的应用奠定了基础。

川续断皂苷B抑制线粒体E3泛素连接酶1减轻缺血性中风大鼠脑损伤

目的探讨川续断皂苷B对缺血性脑卒中的作用及机制。方法SD大鼠和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞分别给予左脑缺血2 h、再灌注24 h和低氧8 h、复氧24 h的处理,在动物水平和离体水平建立缺血性脑卒中模型并给予不同剂量的川续断皂苷B。通过神经功能学评分、TTC染色、TUNEL染色检测大鼠脑损伤以及运用MTS法、LDH细胞毒性释放实验、流式细胞术等手段检测PC12细胞损伤,并运用Western印迹法对相关蛋白水平进行检测。运用MOE分子对接软件对川续断皂苷B和线粒体E3泛素连接酶1(Mul1)进行分子相互作用预测。结果与假手术组相比,模型组大鼠发生了严重脑损伤(神经功能学评分升高、脑梗死灶出现、TUNEL阳性细胞增多,胱天蛋白酶3活性增强、ATP产量减少),同时Mul1和动力相关蛋白1(Drp1)水平升高,mitofusin2(Mfn2)蛋白水平降低。川续断皂苷B能够减弱脑损伤并逆转Mul1,Drp1和Mfn2的蛋白水平改变。离体水平结果一致,与对照组相比,低氧处理的PC12细胞出现了细胞损伤(细胞PI阳性率从5%左右增加至35%左右、胱天蛋白酶3活性增强、LDH释放率增加)和线粒体功能下降(线粒体膜电位ΔΨm和ATP产量下降,ROS产量和线粒体分裂增加),同时Mul1和Drp1表达上调,Mfn2蛋白水平降低,以上现象能被川续断皂苷B抑制。MOE分子对接结果显示,川续断皂苷B可能和Mul1294位Asp、303位和320位Val和318位Gly存在相互作用。结论川续断皂苷B能够通过抑制Mul1改善线粒体功能保护大鼠脑组织免于缺血性损伤。

依托咪酯通过下调含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨依托咪酯(ETO)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)在其中发挥的作用机制。方法分别采用0、1、2和3 mg/L的ETO处理人正常肺上皮细胞系BESA-2B和人NSCLC细胞系A549,细胞计数试剂盒法检测细胞活力;将A549细胞随机分为对照组、ETO(3 mg/L)组、ETO+NC组和ETO+WWP2-OE组,后2组分别于ETO处理后转染空载体pcDNA3.1-NC或WWP2过表达载体pcDNA3.1-WWP2,集落形成试验检测细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中WWP2的mRNA表达;STITCH数据库选择与ETO直接相互作用的蛋白质;蛋白质印迹法检测各组细胞中WWP2、增殖、凋亡和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路相关蛋白表达。结果ETO以剂量依赖性方式显著降低A549细胞活力(F=147.923,P<0.001);而对正常肺上皮BESA-2B细胞活力无影响(F=1.427,P=0.126)。不同浓度(0、1、2、3 mg/L)ETO处理A549细胞后,集落形成数量逐渐减少[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(898±38)、(785±48)、(635±36)、(388±20)个],细胞凋亡率逐渐升高[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(2.23±0.65)%、(7.63±0.35)%、(13.24±0.47)%、(18.93±0.36)%],呈剂量依赖性(F=218.732、352.786,均P<0.001)。STITCH数据库预测ETO可通过上调WWP2蛋白表达和下调PTEN蛋白表达与WWP2和PTEN相互作用。与对照组相比,ETO组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达降低,集落形成数量减少,细胞凋亡率升高,增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞增殖抗原Ki67、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)和PTEN蛋白表达降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高,磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt(p-Akt)/Akt比值降低(均P<0.01);与ETO+NC组比较,ETO+WWP2-OE组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达升高,集落形成数量增多,细胞凋亡率降低,PCNA、Ki67、Bcl-2和PTEN蛋白表达增多,Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高(均P<0.01)。结论ETO可抑制A549细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控WWP2的下调和PTEN/PI3K/Akt通路的激活有关。

CUL4B、TRPM2在胰腺癌组织中的表达和临床意义

目的探讨胰腺癌组织中E3泛素连接酶Cullin4B(CUL4B)、人瞬时受体电位M2(TRPM2)的表达及临床意义。方法收集2019年3月—2020年3月在西安交通大学医学院附属3201医院接受手术治疗胰腺癌患者86例的癌组织和癌旁组织。采用免疫组织化学检测组织中CUL4B、TRPM2蛋白表达。采用实时荧光定量PCR检测组织中CUL4B、TRPM2 mRNA水平。Spearman秩相关分析CUL4B与TRPM2蛋白表达的关系。Kaplan-Meier曲线分析CUL4B、TRPM2蛋白表达对患者预后的影响。Cox比例风险模型分析胰腺癌预后影响因素。结果胰腺癌组织中CUL4B、TRPM2蛋白阳性率及mRNA基因的相对表达量高于癌旁组织(χ^(2)/t=70.245、60.224、15.741、10.976,P均<0.001)。胰腺癌组织中CUL4B与TRPM2蛋白表达呈显著正相关(r=0.720,P<0.001)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移胰腺癌中CUL4B、TRPM2蛋白阳性率高于Ⅰ~ⅡA期、无淋巴结转移癌组织(χ^(2)=16.511、14.834,15.576、15.007,P均<0.001)。CUL4B阳性组和阴性组3年总生存率分别为9.68%(6/62)、41.67%(10/24),TRPM2阳性组和阴性组3年总生存率分别为8.33%(5/60)、42.31%(11/26),CUL4B阳性组、TRPM2阳性组患者3年累积生存率低于CUL4B阴性组、TRPM2阴性组患者(Log-Rankχ^(2)/P=9.933/0.002、11.102/0.001)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移、CUL4B阳性、TRPM2阳性是影响胰腺癌不良预后的独立危险因素[HR(95%CI)=1.781(1.199~2.646),1.962(1.172~3.285),2.482(1.445~4.263),1.733(1.223~2.457)]。结论胰腺癌组织中CUL4B、TRPM2表达升高,两者表达与胰腺癌不良临床病理特征有关,是胰腺癌预后相关肿瘤标志物。

基于TCGA数据库分析DTX2在肾透明细胞癌组织中表达的临床意义及其对肾癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响

目的:基于TCGA数据库分析Deltex E3泛素连接酶2(DTX2)在肾透明细胞癌(ccRCC)组织中的表达水平及临床意义,探讨DTX2对ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:利用TIMER数据库分析DTX2在泛癌组织中的表达水平,通过UALCAN数据库进一步验证ccRCC组织和癌旁组织中DTX2 mRNA和蛋白表达差异。使用UALCAN数据库中的TCGAccRCC队列数据集,分析ccRCC中DTX2表达与患者临床病理特征的相关性。通过K-M plot数据库分析DTX2表达与ccRCC患者预后的相关性。利用DAVID数据库对DTX2相关基因进行GO和KEGG通路富集分析。通过qPCR法检测DTX2基因在人胚肾293(HEK293)细胞和ccRCC细胞A498、Caki-1中的表达水平。利用siRNA技术分别将DTX2 siRNA及其阴性对照质粒转入A498、Caki-1细胞,采用CCK-8法、平板克隆实验、划痕实验及Transwell侵袭实验分别检测敲低DTX2对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果:TCGA数据库分析结果表明,与癌旁组织相比,ccRCC组织中DTX2 mRNA和蛋白均呈高表达(均P<0.01)。DTX2表达水平与ccRCC患者的病理分期、临床分级、不同亚型和淋巴结转移相关联(均P<0.01),DTX2高表达与患者的不良预后具有相关性(均P<0.01)。GO功能和KEGG通路富集分析结果显示,DTX2表达相关基因主要参与蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢等生物学过程,并主要富集到了mTOR信号通路等与肿瘤的相关信号通路中(均P<0.05)。体外细胞实验结果表明,A498和Caki-1细胞中DTX2表达水平高于HEK293细胞;敲低DTX2表达可显著降低A498和Caki-1细胞的增殖、迁移及侵袭能力(均P<0.01)。结论:DTX2在ccRCC组织和细胞中呈高表达,其高表达患者的预后较差。敲低DTX2表达可抑制ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭,DTX2有望成为ccRCC新的生物标志物和治疗靶点。

siah E3泛素蛋白连接酶2对胰腺癌细胞增殖的影响及机制

目的检测siah E3泛素蛋白连接酶2(SIAH2)对胰腺癌细胞增殖的影响及探讨其机制。方法应用生物信息学分析胰腺癌与SIAH2的临床相关性。用免疫组织化学(IHC)染色检测癌组织与癌旁组织中SIAH2的表达量。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及蛋白质印迹法(Western blot)检测胰腺癌细胞和正常胰腺导管细胞中基因的表达。用SIAH2的小干扰RNA(siRNA)感染PANC-1及SW1990胰腺癌细胞;5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EDU)和细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测SIAH2对胰腺癌细胞增殖的影响。组间比较采用t检验。结果生物信息学及IHC实验显示SIAH2在胰腺癌中表达升高(P<0.05)。SIAH2的表达与患者的总生存期和无病生存期呈负相关,与肿瘤分级、分期和T分期相关(P<0.05)。RT-qPCR及Western blot结果显示,正常胰腺导管细胞(HPDE)中SIAH2 mRNA及蛋白表达量低于胰腺癌细胞(BXPC-1、PANC-1、SW1990、MIA-PaCA-2、ASPC-1)(RT-qPCR:0.997±0.047比2.533±0.404比3.000±0.458比2.800±0.400比2.267±0.351比1.667±0.153,t=6.489、7.247、7.570、5.536、10.220,P<0.05;Western blot:1.000±0.027比1.740±0.187比2.213±0.474比2.242±0.328比1.734±0.209比1.898±0.189,t=7.697、4.672、7.139、6.219、7.925,P<0.05)。敲低SIAH2后胰腺癌细胞增殖能力降低。Western blot实验结果发现,siRNA组SMO、GLI1、PCNA表达低于NC组[SMO:PANC-1(0.999±0.019比0.473±0.010比0.412±0.017;t=92.380、34.670);SW1990(1.000±0.054比0.476±0.023比0.453±0.017;t=21.740、14.010);GLI1:PANC-1(0.999±0.014比0.484±0.040比0.514±0.039;t=2.817、2.790);SW1990(1.004±0.030比0.443±0.024比0.476±0.018,t=24.860、50.780);PCNA:PANC-1(0.999±0.007比0.390±0.030比0.390±0.079,t=24.240、13.790);SW1990(1.001±0.016比0.534±0.050比0.450±0.026,t=14.080、50.540,P<0.05)]。在回复实验中,敲低后的SIAH2加入SAG后,细胞增殖能力恢复,并且Western blot实验结果发现,si-SIAH2#1+SAG组SMO、GLI1、PCNA表达高于si-SIAH2#1组[SMO:PANC-1(0.974±0.018比0.466±0.012,t=36.200);SW1990(0.965±0.026比0.410±0.018,t=6.880);GLI1:PANC-1(1.005±0.023比0.464±0.042;t=20.850);SW1990(1.002±0.021比0.504±0.018,t=21.980);PCNA:PANC-1(0.956±0.036比0.501±0.015,t=16.580);SW1990(0.989±0.066比0.535±0.031,t=8.620,P<0.05)]。si-SIAH2#2+SAG组SMO、GLI1、PCNA表达高于si-SIAH2#2组[SMO:PANC-1(1.002±0.043比0.410±0.018,t=18.200);SW1990(1.000±0.015比0.415±0.023,t=49.400);GLI1:PANC-1(0.999±0.077比0.458±0.043,t=15.610);SW1990(0.974±0.030比0.527±0.037,t=26.350);PCNA:PANC-1(0.974±0.014比0.512±0.021,t=47.470);SW1990(1.000±0.035比0.535±0.053,t=14.320,P<0.05)]。结论SIAH2在胰腺癌组织及细胞中高表达及表达量与患者预后负相关,且SIAH2通过Hedgehog通路促进胰腺癌细胞增殖。

拟南芥AtHHR2与DREB2C的相互作用研究

已有研究表明拟南芥Highly Homologous RING domain 2(At5g43200,命名为AtHHR2)基因在盐胁迫中起正调控作用,并且其同源基因AtHHR3基因在酵母双杂交实验筛选中与DREB2C基因有相互作用.本研究利用体外、体内蛋白质相互作用实验以及生物化学方法进一步探究了AtHHR2的功能性.体外Pull-down实验证实了AtHHR2与DREB2C有体外的相互作用.体外泛素化实验进一步验证了它们之间的相互作用,且AtHHR2起到E3连接酶的作用.为了进一步确定它们的关系,我们用双分子荧光互补实验,在体内分别验证了AtHHR2与DREB2C之间确实有相互作用.综上所述在拟南芥中AtHHR2与DREB2C有相互作用关系,且AtHHR2起到E3连接酶的作用.

miR-126-5p通过靶向Peli2影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化发生

目的探讨微小RNA-126-5p(miR-126-5p)通过靶向pellino E3泛素蛋白连接酶家族成员2(Peli2)影响糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)发生的分子机制。方法本研究起止时间为2018年12月至2019年12月。体外培养人肾小管上皮细胞HK-2(美国ATCC),分别使用5 mmol/L、30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h,分别记作对照组、模型组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测miR-126-5p、Peli2的表达水平。利用脂质体转染法分别将miR-126-5p寡核苷酸模拟物(miR-126-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、Peli2小分子干扰RNA(si-Peli2)及其阴性对照(si-NC)转染至HK-2细胞,使用30 mmol/L的D-葡萄糖处理细胞48 h。Western blot检测上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指蛋白(Snail)表达量;双荧光素酶报告实验验证miR-126-5p与Peli2的靶向关系。结果与对照组相比,模型组miR-126-5p[(1.00±0.10)比(0.32±0.03)]、E-Cadherin[(0.86±0.09)比(0.35±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05),Peli2[(0.42±0.04)比(1.05±0.11)]、N-Cadherin[(0.45±0.05)比(0.99±0.10)]、Vimentin[(0.32±0.03)比(0.92±0.09)]、Snail[(0.22±0.02)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05);转染miR-126-5p mimics,与转染miR-NC相比,E-Cadherin[(0.34±0.03)比(0.75±0.08)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.02±0.11)比(0.53±0.05)]、Vimentin[(0.95±0.10)比(0.48±0.05)]、Snail[(0.72±0.07)比(0.36±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);转染si-Peli2后,与转染si-NC相比,E-Cadherin[(0.24±0.03)比(0.70±0.07)]的表达水平显著升高(P<0.05),N-Cadherin[(1.05±0.12)比(0.50±0.05)]、Vimentin[(0.96±0.10)比(0.38±0.04)]、Snail[(0.74±0.07)比(0.40±0.04)]的表达水平显著降低(P<0.05);miR-126-5p能够特异性结合Peli2,Peli2是miR-126-5p的靶基因;Peli2过表达后可明显逆转miR-126-5p过表达对高糖诱导的HK-2细胞EMT的影响。结论miR-126-5p通过靶向Peli2抑制糖尿病肾病肾小管上皮细胞EMT发生。

组蛋白去乙酰化酶HDAC2突变体构建及其SUMO修饰E3连接酶功能研究

目的:针对人源HDAC2外显子拼接功能区(CDS)基因,运用双管法突变体构建技术,构建HDAC2去乙酰化酶功能失活的片段缺失与关键位点突变体,检测突变体的SUMO化修饰E3连接酶功能活性,探究此HDAC2新功能是否受到其固有的去乙酰化酶功能的影响。方法:设计HDAC2 100-322位氨基酸密码子缺失的片段突变体引物与142位H→A点突变体引物,利用HDAC2的pcDNA3.1真核表达质粒为模板,通过耐热Fusion酶PCR反应双管扩增相应的单链DNA,并经退火、模板酶切、乙醇纯化、感受态转化、抗性平板筛选、测序鉴定获得两种HDAC2去乙酰化酶功能失活的pcDNA3.1真核表达质粒。免疫印迹检测突变体质粒在细胞中的表达,荧光素酶(LUC)报告基因实验检测其SUMO化修饰E3连接酶功能活性。结果:成功构建HDAC2去乙酰化功能失活的片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2(DEL 100-322AA)与关键位点突变体pcDNA3.1/HDAC2(142 H→A)。C-myc标签的免疫印迹检测显示两种突变体在细胞中可稳定表达。将突变体转染进入三种细胞,LUC报告基因分析结果显示突变体仍具有E3连接酶功能活性。结论:HDAC2的E3连接酶功能不依赖于其去乙酰化酶活性,并且E3连接酶功能结构域位于其序列C端。