基于TaqMan探针非洲猪瘟病毒E301R基因荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立基于TaqMan探针的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)E301R基因荧光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法,并进行验证,以期应用于临床样本中ASFV的检测。方法通过对ASFV E301R基因序列进行分析,选择基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针。PCR扩增E301R基因片段,克隆至pCAGGS载体,构建质粒标准品,建立基于TaqMan探针的qPCR检测方法,并验证方法的线性范围、精密性、特异性、敏感性及准确性。采用建立的方法检测92份临床样本,并与商品化ASFV荧光PCR试剂盒检测结果进行比较。另采用建立的方法对E301R基因转录动力学进行分析。结果质粒标准品在1.6×(10^(1)~108)拷贝/μL范围内,与Ct呈良好的线性关系,线性回归方程为:y=-3.239 x+40.774,R2=0.994;重复性及中间精密性验证CV均<2%;除ASFV外,猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)均未出现扩增曲线;最低可稳定检出1.6×10^(1)拷贝/μL的质粒标准品;浓度为1.6×10^(2)和1.6×10^(1)拷贝/μL质粒标准品的加标回收率在90%~110%之间。建立的方法与商品化ASFV荧光PCR试剂盒对92份临床样本检测结果的符合率为96.7%(Kappa=0.932,P=1.000)。E301R基因可能为ASFV感染的中期转录基因。结论建立的基于TaqMan探针的qPCR检测方法具有良好的精密性、特异性、敏感性及准确性,可用于临床样本中ASFV的检测。