非洲猪瘟病毒E301R蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)E301R蛋白单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达并纯化了重组E301R蛋白(r E301R)。将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E301R蛋白MAb的杂交瘤细胞株8B3,亚类鉴定结果显示8B3 MAb为IgG1型。利用一系列表达部分重叠的重组E301R片段并经western blot鉴定8B3 MAb识别的抗原表位,结果显示,8B3 MAb识别的抗原表位为^(1)MSEDIRRGPGRPPKKRVVPN。采用western blot检测制备的8B3 MAb与HEK293T细胞中过表达的E301R蛋白(不同剂量)及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后(感染后不同时间)天然表达的E301R蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测8B3 MAb与293T细胞中过表达的E301R蛋白的反应性及E301R蛋白在细胞中的定位。Western blot结果显示,过表达E301R蛋白的293T细胞出现了36 ku左右的特异性条带,且随着转染质粒量的增加,蛋白表达量增加;感染ASFV的PAM中(感染后8 h)出现了36 ku左右的特异性条带,且随着感染时间的延长,蛋白表达量增加。IFA结果显示,在过表达E301R蛋白的293T细胞中出现绿色荧光,且其定位于细胞质中。以上结果表明,制备的8B3MAb既能够与过表达的E301R蛋白,也能够与天然表达的E301R蛋白反应,反应性较强。将8B3 MAb用于免疫共沉淀(Co-IP)试验检测293T细胞中过表达的E301R蛋白和Flag-Agarose结合后与8B3 MAb的反应性。结果显示,8B3 MAb可以检测到结合在Flag-Agarose上的E301R蛋白,出现约36 ku的特异性条带。表明8B3 MAb可以用于Co-IP试验。这些研究结果为进一步研究E301R蛋白的功能奠定实验基础。