E3L基因缺失型痘苗病毒的构建

目的构建E3L基因缺失型痘苗病毒,并评价其毒力和安全性。方法根据天坛株痘苗病毒全基因组设计合成以E3L基因为重组臂,并含有Loxp序列、早晚期复合强启动子(PE/L)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、终止信号(T5nT)的重组痘苗病毒穿梭质粒pVTTΔE3L-EGFP,然后利用同源重组和Cre/Loxp系统构建E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L。检测VTTΔE3L对BHK-21、HEK-293、OA3.TS、Marc-145和DF-1细胞存活率的影响并测定其在上述细胞中的一步生长曲线,初步明确VTTΔE3L的毒力和复制能力;连续传代40代,检测VTTΔE3L的遗传稳定性;滴鼻感染BALB/c小鼠,检测其对小鼠体重变化的影响,初步明确VTTΔE3L的安全性。结果利用EGFP筛选标记和Cre/Loxp特异性敲除系统,通过多次挑斑筛选获得了E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L,且PCR鉴定VTT目的条带大小为359bp,rVTTΔE3L-EGFP目的条带大小为1206bp。结晶紫染色图表明VTTΔE3L对BHK-21细胞的抑制作用明显弱于VTT,通过连续传代40代,PCR没有检测到重组痘苗病毒VTTΔE3L的目的条带,确定了VTTΔE3L具备良好的遗传稳定性。细胞生存率检测表明随作用时间的延长VTTΔE3L对不同株细胞的杀伤作用显著低于VTT,在48h和72h时VTTΔE3L与VTT对不同细胞的抑制作用存在显著性差异(P<0.01)。VTTΔE3L在受试细胞中的一步生长曲线表明VTTΔE3L的复制能力未受到明显影响。体内试验表明BALB/c小鼠接种第9d开始,VTT组小鼠体重开始迅速下降且显著低于PBS组和VTTΔE3L组(P<0.01),而VTTΔE3L组和PBS组小鼠体重并未受到影响且两者无显著性差异(P>0.05)。结论成功获得E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L,其安全性良好,为以痘苗病毒为载体的疫苗研究和临床应用奠定了基础。