36型人腺病毒腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)的原核表达及多克隆抗体制备

目的利用分子克隆技术构建36型腺病毒(Ad36)腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)重组原核表达质粒pET30a-E4ORF1,经诱导表达后,制备并纯化获得E4ORF1抗原,经免疫兔后获得多克隆抗体。方法根据NCBI数据库中人Ad36基因组全序列,设计引物、PCR扩增其中的E4ORF1基因全长并将其克隆至原核表达载体中、测序。将测序正确的原核表达质粒pET30a-E4ORF1转化至E.coliBL21(DE3)菌株中,通过探索E4ORF1蛋白的最佳诱导条件后,对重组蛋白进行大量诱导表达和纯化。将纯化获得的重组蛋白免疫新西兰白兔,在5次免疫后分离血清,ELISA检测抗体效价。抗原亲和纯化出E4ORF1多克隆抗体,Western blot法检测抗体的特异性。结果成功扩增E4ORF1基因,经测序比对与GenBank序列一致,大小为408 bp,证明成功构建原核重组表达质粒。经鉴定重组蛋白的相对分子质量(M_(r))约14000,ELISA检测5次免疫后兔血清抗体效价达1∶320000。Western blot法证明该抗体具较高的特异性。结论成功表达E4ORF1蛋白,并制备了高特异性的兔抗E4ORF1多克隆抗体。

逆转录病毒介导的稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白的胎肝窦内皮细胞株的建立

目的:为构建优化的内皮细胞用于造血干细胞(HSCs)的支持培养,通过逆转录病毒载体系统建立稳定表达腺病毒E4区开放读框1(E4orf1)和绿色荧光蛋白(GFP)的人胎肝窦内皮细胞(HFLSECs)株。方法:利用Plat-A细胞将质粒MSCV-N E4orf1和p MX-GFP分别包装为逆转录病毒,共同感染HFLSECs,将原代培养的HFLSECs和转基因的HFLSECs分别在含有0.5、1、2、4μg/m L嘌呤霉素的EGM-2培养基中培养,以测试最适药物筛选浓度,药筛1周后通过流式细胞分选获得稳定转染E4orf1的GFP^+HFLSECs(E4orf1-GFP/HFLSECs)。通过密度梯度离心法从脐带血中分离单个核细胞,利用免疫磁柱分选获得CD34^+造血干/祖细胞(HSPCs),以E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层联合SCF、TPO、Flt-3L等3种基础造血相关因子进行体外扩增和半固体造血细胞集落培养。结果:0.5μg/m L嘌呤霉素在5 d内即能完全杀死HFLSECs,而转基因的HFLSECs可以正常存活,以此药物浓度加压筛选1周,后续通过流式分选GFP阳性细胞,阳性率为90.5%,在E4orf1-GFP/HFLSECs饲养层支持下,人脐带血来源的CD34^+细胞15 d扩增了360倍,是单纯细胞因子悬浮培养组的2.2倍,且扩增后的HSPCs在体外仍具有多种造血集落形成能力。结论:该细胞株的建立将为构建造血干细胞体外培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境。