人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定

目的利用人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)58突变型E6E7(Mutant type E6E7,mE6E7)融合基因为靶点,巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102 Towne bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC)为载体,构建携带HPV58 mE6E7融合基因的重组病毒,探讨HPV58mE6E7的转化活性。方法PCR扩增带有50 bp Towne开放读码框(open reading frame,ORF)75左右同源臂的GalK、mE6E7及野生型E6E7(Wild type E6E7,wE6E7)融合基因片段,切胶回收纯化;将GalK片段电转到(SW102-T-BAC)感受态细胞,经过同源重组、GalK及氯霉素抗性筛选,获得SW102-T-ORF75-Galk-BAC克隆;然后分别将纯化的mE6E7及wE6E7电转到SW102-T-ORF75-Galk-BAC感受态细胞,经脱GalK及氯霉素抗性筛选,获得SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC克隆;提取所得克隆质粒DNA,转染ARPE-19细胞(以转染SW102-T-BAC的细胞及未转染细胞为对照),逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中mE6E7及wE6E7的表达状况;观察重组病毒T-ORF75-mE6E7及T-ORF75-wE6E7对转染ARPE-19细胞的影响,通过软琼脂克隆分析mE6E7及wE6E7转化活性。结果获得了SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的克隆。逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中mE6E7及wE6E7的表达正确。转染SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制,出现重叠生长现象,其形态由原来梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多;并且在软琼脂中能够形成克隆;而转染SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC、SW102-T-BAC及未转染细胞未出现上述细胞的特点。结论获得了T-ORF75-mE6E7及T-ORF75-wE6E7重组病毒,并且重组病毒T-ORF75-mE6E7的转化活性已消除,为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。

HPV16、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体的构建

目的:构建一种含人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型E6/E7融合基因痘苗病毒表达载体。方法:PCR扩增HPV16型、18型E6、E7基因,克隆到pSC-A载体中,通过定点突变方法,分别构建成含E6/E7融合基因的质粒,即pSC-A-HPV16 E6/E7和pSC-A-HPV18 mE6/E7,并将二者连接成载体pSC-A-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pSC-T,HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7:T),最后以痘苗病毒表达载体pJ38为转移载体,构建质粒pJ38-HPV16 E6/E7-HPV18mE6/E7(pJ38-T),对所有重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。结果:E6/E7融合基因成功克隆到pJ38上。结论:成功构建表达HPV E6/E7融合基因重组痘苗病毒载体,为研制宫颈癌治疗性疫苗奠定基础。