重组腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞影响的动物试验

目的探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定最佳转染复数(MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下制作鼻咽癌异位肝种植的肝肺转移模型,观察肝脏成瘤及肝内、肺转移情况,分析LMP-1基因沉默在动物水平对鼻咽癌细胞成瘤及转移能力的影响。结果rAAV-EGFP以5×104v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×104v.g/细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90%,动物试验结果显示rAAV-shRNA-LMP-1组肝脏成瘤体积与对照组rAAV-EGFP无显著差异,但显著减少了种植肿瘤的肝内及肺转移率。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,可在动物水平抑制鼻咽癌细胞转移,但对鼻咽癌细胞生长无显著影响。

鼻咽癌C666-1细胞中EBV miRNA的表达情况及其功能研究

目的观察鼻咽癌C666-1细胞中EB病毒(EBV)所编码的44个miRNA的表达情况(即BART、BHRT家族的表达情况)及BART-15对EBV的即刻早期基因(BZLF-1)表达的影响。方法培养C666-1细胞,取对数生长期的细胞,提取RNA,采用polyA加尾PCR法对EBV miRNA进行扩增,观察BHRF和BART家族的表达情况。将BART-15抑制剂转染C666-1细胞,转染成功后,用real-time PCR法检测BZLF-1的表达。结果在EBV编码的44个miRNA中,BHRF家族的表达普遍低于BART家族。BART-15抑制剂转染C666-1细胞后,转染率为77.0%,BART-15的表达降低了87%。抑制C666-1细胞中BART-15的表达后,BZLF-1的表达增高了2.54倍。结论鼻咽癌C666-1细胞中EBV的miRNA表达谱存在家族性差异,其中的BART-15可能直接或间接作用于EBV的BZLF-1,影响EBV的感染状态。

胃癌EB病毒编码小RNA的原位杂交研究

目的 :探讨非洲淋巴细胞瘤病毒编码小 RNA (EBER- 1)在胃癌中表达及与组织学类型的关系。方法 :应用 EBER- 1的原位分子杂交技术对 10 0例胃癌进行检测。结果 :10 0例胃癌中有 2例 EBER- 1呈阳性表达 ,其中1例为管状腺癌 ,1例为低分化腺癌。 2例均有淋巴细胞浸润倾向 ,与组织学类型无关。结论 :EB病毒相关胃癌占胃癌的比率 (2 % )低于日本 (7%～ 11% )和北美 (16 % )

siRNAs干扰EBNA1下调EBV阳性鼻咽癌细胞内ALOX12的表达

【目的】利用RNA干扰技术抑制C666-1细胞中EB病毒核抗原1(EBNA1)的表达,探索氧化应激与抗氧化相关基因的表达变化。【方法】采用蛋白质印迹证实了能有效抑制EBNA1表达的干扰序列,使用甲基噻唑基四唑(MTT)方法检测C666-1细胞的存活率,利用实时定量PCR芯片技术探索了氧化应激与抗氧化相关基因的转录谱变化,并通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹进行了验证。【结果】EBNA1-1414和EBNA1-1437干扰序列转染C666-1细胞48h后,分别可抑制59%和56%的EBNA1蛋白表达,细胞存活率分别降低了33%和24%。PCR芯片实验发现干扰EBNA1表达后48hC666-1细胞中花生四烯酸盐12-脂氧合酶(ALOX12)蛋白表达有下调,谷胱甘肽还原酶(GSR)和过氧化物酶3(PRDX3)在转录水平表达上调。【结论】EBNA1或许能够通过上调ALOX12的表达间接地发挥促鼻咽癌作用。

鼻咽癌组织中EB病毒的不同原位检测方法比较

目的：探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测ＥＢ病毒的更快速、更灵敏的方法。方法：用地高辛标记的寡核苷酸ＥＢＥＲ－１和ＥＢＶ ＤＮＡ的 ＢａｍＨＩ－Ｗ片段为探针，分别用原位杂交、原位ＰＣＲ检测鼻咽癌组织切片中ＥＢＶ的分布情况。结果：用寡核苷酸ＥＢＥＲ－１作探针原位杂交检测ＥＢ病毒的方法比用ＢａｍＨＩ－Ｗ片段作探针原位杂交及原位ＰＣＲ的方法更灵敏、更简单。结论：用ＥＢＥＲ－１作探针原位杂交检测鼻咽癌组织切片中ＥＢ病毒的方法不失为一种简单、快速、灵敏的方法。

一种基于人miR-30结构高效干扰LMP1基因表达的慢病毒载体的构建

目的:构建慢病毒载体并利用miRNA原理进行LMP1病毒癌基因干扰的可行性及有效性研究。方法:基于人miR-30a结构,利用靶点分析软件设计4个LMP1的候选干扰靶点,报告基因EGFP与miRLMP1靶点形成共顺反子表达,靶点载体质粒与LMP1高表达质粒用脂质体共转染工具细胞293FT,用Western blot方法筛选最有效的干扰靶点并用三质粒系统在293FT细胞中包装慢病毒,进行滴度鉴定。结果:在293FT工具细胞中成功筛选到一个高效干扰LMP1基因的靶点序列,在Western blot水平的蛋白干扰率高达95%;在20ml培养上清中可获得具有活性慢病毒颗粒7.2×108个,经纯化浓缩获得重组慢病毒颗粒,滴度高达6×109TU/ml,经流式细胞仪检测在80MOI时其感染EBV阳性的鼻咽癌细胞株C666-1的感染率高达80%以上。结论:基于人miR-30a结构的miR-LMP1能高效干扰LMP1基因的蛋白表达,利用慢病毒载体来建立稳定基因干扰肿瘤细胞株可能是一个良好的方法。

小干扰RNA抑制EB病毒潜伏膜蛋白1表达对鼻咽癌细胞生长的影响

目的探讨人工诱导RNA干扰技术在EB病毒潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP-1)功能研究中的应用价值,观察LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞生长的影响。方法人工合成4条双链不同序列的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),通过脂质体转染导入表达EB病毒基因的鼻咽癌C611细胞后,用半定量逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RTPCR)检测LMP1mRNA水平,筛选出能有效抑制LMP-1表达的siRNA序列。采用噻唑蓝法和流式细胞仪观察LMP1表达抑制后,鼻咽癌细胞增殖、凋亡以及细胞周期的变化。结果导入有效siRNA后,C611细胞中LMP-1mRNA水平下降90%以上,重复转染可使有效干扰时间延长至96h。LMP-1基因抑制后,EB病毒阳性的C611细胞增殖速度最多可下降至32.9%;细胞周期在G0G1期受阻。在同样处理下,EB病毒阴性的HNE2细胞的生长则未受到影响。结论全新的人工诱导RNA干扰技术能够有效抑制LMP1基因的表达,降低鼻咽癌细胞的增殖能力,为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。

用EBER-1作探针原位杂交检测鼻咽癌组织中的EB病毒

ｐｓｔｅｉｎＢａｒ病毒（ＥＢＶ）与鼻咽癌（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＮＰＣ）有非常密切的关系［１］。各家检测ＥＢＶＤＮＡ的方法均不完全相同，灵敏度也存在差异［１４］。原位杂交是比较传统的方法，但用ＥＢＶＤＮＡ片段作探针原...

EB病毒阳性肺癌组织中LMP-1、p53、Bcl-2及MMP-9表达

[目的]检测EB病毒(EBV)阳性肺癌组织中EBV潜伏感染膜蛋白-1(LMP-1)、p53、Bcl-2及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达情况,分析它们与肺癌发生发展的关系。[方法]采用原位杂交法检测108例肺癌组织和22例癌旁正常肺组织中EBV编码的小RNA-1(EBV encoded small RNA-1,EBER-1)。免疫组织化学的方法检测EBER-1阳性和阴性肺癌组织中LMP-1、p53、Bcl-2及MMP-9的表达。[结果]108例肺癌组织中EBER-1阳性36例,阳性率33.3%;22例癌旁正常肺组织中EBER-1阳性1例,阳性率4.5%,差异有统计学意义(P<0.01)。EBER-1阳性和阴性的肺癌组织中LMP-1阳性率分别为11.1%和4.2%,差异无统计学意义(P>0.05);在EBER-1阳性肺癌组织中p53、Bcl-2的平均面积(AA)和积分光密度(IOD)均高于阴性组,差异有统计学意义。在EBER-1阳性肺癌组织中MMP-9AA和IOD均高于阴性组,但差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]EBV感染可能通过影响LMP-1、Bcl-2、p53和MMP-9在肺癌组织中的表达,进而在肺癌的发生、发展和转移中发挥作用。

EB病毒潜伏膜蛋白LMP1编码基因沉默对NF-κB表达的影响

目的:探讨EBV阳性胃上皮细胞中潜伏膜蛋白1(latent membrane protein1,LMP1)基因沉默对NF-κB转录表达的影响。方法:以稳定表达LMP1的EBV阳性胃上皮细胞系作为靶细胞,采用化学合成的siRNA特异性沉默LMP1,用RT-PCR和West-ern-blotting分别检测其在不同时间段mRNA和蛋白水平特异性沉默效果;Western blotting及免疫酶染色法检测LMP1基因沉默对NF-κB转录表达及核转移的影响。结果:siRNA在mRNA和蛋白水平可特异性沉默LMP1的表达,且有时间效应关系;West-ern blotting及免疫酶染色法检测结果显示LMP1沉默可干扰NF-κB表达,导致靶细胞核内NF-κB水平下降,细胞浆内水平升高,而NF-κB总蛋白有下降趋势。结论:LMP1基因特异性沉默能够影响NF-κB表达,抑制其核转移。

B型胸腺瘤组织IL-1、IL-6及EBER-1基因表达与EBV感染的关系

目的研究B型胸腺瘤胸腺组织白细胞介素(IL)-1、IL-6及EBER-1基因表达与EB病毒(EBV)感染的关系。方法选择海南医学院第一附属医院心胸外科2016年2月-2021年4月收治的90例B型胸腺瘤患者作为研究对象,另选择同期因其他原因手术切除胸腺患者作为对照组(71例),进行回顾性分析,均检测患者胸腺组织IL-1、IL-6及EBER-1基因表达情况。分析上述因子在B型胸腺瘤各亚型以及临床分期中的分布情况,根据患者有无EBV感染分为感染组(49例)和未感染组(41例),通过Logistic回归分析IL-1、IL-6表达与EBV感染的关系。结果研究组患者IL-1、IL-6及EBER-1基因表达阳性率高于对照组(P<0.05);不同分期患者IL-1表达阳性率比较存在统计学差异,随着临床分期的升高,IL-1、EBER-1基因表达阳性率逐渐升高(P<0.05);Logistic回归分析显示临床分期(Ⅲ、Ⅳ期)、IL-1表达(阳性)和IL-6表达(阳性)是影响B型胸腺瘤患者EBV感染发生的影响因素(P<0.05)。结论IL-1、IL-6及EBER-1基因在B型胸腺瘤组织中广泛表达,且IL-1、EBER-1基因表达与胸腺瘤的临床分期相关,EBV感染与胸腺瘤的发生有一定的相关性,并可能通过引起患者体内IL-1、IL-10因子表达的改变促进疾病的进展。

耳、鼻、咽、喉

听神经瘤TGF-β1的表达及其与肿瘤细胞增殖的相关性研究；河南省1984～2003年鼻咽癌死亡率分析；鼻咽癌组织线粒体DNA突变的研究；质粒表达的短发夹状RNA特异性抑制鼻咽癌细胞的增殖；内皮素受体A表达与鼻咽癌预后的关系；小干扰RNA抑制EB病毒潜伏膜蛋白1表达对鼻咽癌细胞生长的影响；MRI及CT对鼻咽癌T分期的不同影响；鼻咽癌放疗前血红蛋白对局部控制的影响。