EBNA2免疫组化在EB病毒阳性淋巴组织疾病中的表达意义

目的观察EBNA2免疫组化在不同EB病毒阳性淋巴组织疾病中的表达差异、分析其在病理诊断与鉴别诊断中的价值。方法收集344例EB病毒阳性的淋巴组织疾病,总结EBNA2免疫组化在病变中的表达特点。结果不同的EBV阳性淋巴组织病变,EBNA2的阳性表达不同:IM中阳性39例(39/46),EBV阳性的弥漫大B细胞淋巴瘤3例(3/30),淋巴瘤样肉芽肿1例(1/5),纤维素相关弥漫大B细胞淋巴瘤2例(2/2),浆母细胞淋巴瘤1例(1/14),免疫相关淋巴组织增殖性疾病32例(32/58)(包括移植后淋巴组织增殖性疾病21例,HIV相关Burkitt淋巴瘤1例,HIV相关弥漫大B细胞淋巴瘤2例,原发免疫缺陷疾病相关淋巴组织疾病6例,医源性免疫相关淋巴组织增殖性疾病2例)。其余均显示EBNA2阴性。②不同病变中的EBNA2阳性细胞表达明显不同:传染性单核细胞增多症中的EBNA2阳性细胞相对较少,并且多呈散在分布,几乎很少见到簇状聚集的情况。EBNA2阳性细胞多表现为≤10个/HPF,少见11~50个/HPF,仅有个别病例显示大于50个/HPF。免疫相关淋巴组织增殖性疾病中,出现大量EBNA2阳性细胞,阳性细胞较弥漫分布,大部分为强阳性,并且阳性细胞多显示大于50个/HPF。结论EBNA2阳性在疾病的诊断及鉴别诊断提供了新的依据,具有一定的价值;当病变表达EBNA2时,提示患者可能存在免疫缺陷或处于免疫失调状态,对临床诊断及治疗具有一定的指导意义。

EBNA1-IgG抗体阳性患者免疫功能与肝功能损害的关系分析

目的:探究EBNA1-IgG抗体阳性患者免疫功能变化与肝功能损害的关系。方法:选取2020年4月至2023年4月于我院就诊的78例EBNA1-IgG抗体阳性患者为研究对象。根据肝功能是否受损分为肝功能正常患者为观察组(44例)和肝功能异常患者为对照组(34例)。比较两组患者空腹血清免疫球蛋白(IgM、IgG和IgA)水平和白细胞计数(White Blood Cell Count,WBC)、淋巴细胞计数(Lymphocyte count,Lym)、中性粒细胞计数(Neutrophil count,NEUT)。采用Pearson相关性分析EBNA1-IgG抗体阳性患者免疫功能变化与肝功能损害的相关性。分析EBNA1-IgG抗体阳性患者肝功能损害的危险因素。结果:观察组IgM、IgG、IgA均低于对照组,其中IgG和IgA差异具有统计学意义(P<0.05),IgM差异无统计学意义(P>0.05)。观察组WBC、Lym和NEUT指标低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,EBNA1-IgG抗体阳性患者肝损伤与IgG、IgA、WBC、Lym和NEUT呈正相关。Logistic回归分析显示,Lym(OR=1.612,95%CI:1.056~2.459)为EBNA1-IgG抗体阳性患者合并肝功能损伤的独立危险因素。结论:EBNA1-IgG抗体阳性患者免疫功能变化与肝功能损害密切相关。

泛素与EB病毒核抗原1融合基因的DNA免疫研究

构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)基因的表达质粒pCI-EBNA1和泛素(ubiquitin,Ub)与EBNA1融合基因的表达质粒pCI-Ub-EBNA1。间接免疫荧光和Westernblot分析表明,两重组质粒转染HeLa细胞后均能瞬时表达。两种质粒DNA肌肉注射免疫Balb/C小鼠后,分别检测小鼠血清抗EBNA1的抗体和特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较单基因与融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果显示:二者诱生抗体的效率无明显差别,但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强。

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 。

EB病毒早期弥散型抗原基因片段BMRF1真核表达质粒的构建

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方常见的一种恶性肿瘤,目前筛查鼻咽癌最特异的手段就是通过酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法检测患者血清中EB病毒早期抗原（EA）-Ig A抗体[1,2]。EA抗原是EB病毒感染细胞后早期合成的一种蛋白,可以进一步分为弥散型（D型）和局限型（R型）抗原。

V-val突变型EB病毒核抗原1的功能研究

背景与目的:EB病毒核抗原1(Epstein-Barr viral nuclear antigen 1,EBNA 1)对于维持EB病毒的潜伏感染有重要作用。V-val变异型的EBNA1与鼻咽癌有密切的相关性。本研究旨在比较原型和V-val变异型的EBNA1基因在上皮细胞中的功能的差异。方法:用PCR方法扩增出原型和V-val变异型EBNA1基因的全长并克隆到pGFP载体上,转染HEK293细胞,检测两种亚型的EBNA1蛋白的表达对细胞生物学性状的影响。以含有EB病毒增强子FR序列的荧光素酶载体作为报告基因,比较两种亚型的EBNA1基因对质粒的转录激活能力。结果:原型和V-val变异型EBNA1基因的表达对HEK293细胞的生长速度没有明显影响,但表达原型EBNA1的细胞的克隆形成能力明显低于V-val亚型。在裸鼠致瘤实验中,接种表达原型和V-val变异型EBNA1细胞的实验组均未见肿瘤形成。但是在瞬时转染实验中,表达V-val变异型EBNA1基因的HEK293细胞的荧光素酶活性明显高于原型EBNA1基因。结论:原型和变异型EBNA1均未发现有明显的转化细胞的能力,但是V-val变异型EBNA1蛋白与原型相比,其转录激活的功能明显增强。

EB病毒核抗原1羧基端原核表达产物的纯化方法

EB病毒核抗原 1羧基端的原核表达产物以包涵体和可溶性两种形式存在,用镍离子亲和柱分别对其进行了纯化。结果显示,可溶性部分以及经 2M尿素溶解后的包涵体的最适咪唑洗脱浓度均为 150mM。纯化后重组蛋白的纯度在 90%以上。

EB病毒诱发淋巴瘤中EB病毒核抗原-1的表达

目的:检测EB病毒(EBV)诱导正常人淋巴细胞发生肿瘤前后EB病毒核抗原-1(EBNA-1)的差异表达情况,为研究EBV诱发淋巴瘤的发生机制提供实验依据。方法:构建SCID小鼠体内EBV诱发淋巴瘤的动物模型,分别采用实时定量PCR和Western blot方法检测EBNA-1基因的表达情况。结果:成功复制EBV诱发淋巴瘤动物模型,EBNA-1基因在6例"正常人"淋巴细胞和3例诱发淋巴瘤细胞中均有表达,在诱发淋巴瘤细胞中的表达比在正常人淋巴细胞中的表达上调11 683倍,差异有统计学意义。Western blot结果显示,与正常人淋巴细胞组相比,EBNA-1在诱发淋巴瘤细胞的蛋白表达明显升高。结论:EBV诱发淋巴瘤中EBNA-1的表达上调,EBNA-1在EB病毒诱发淋巴瘤的形成过程中可能起重要作用。

5-Aza-CdR联合EBNA1-DC疫苗诱导的淋巴细胞对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用

目的:探讨EB病毒核抗原1(EBNA1)mRNA修饰的DC(EBNA1-DC)诱导的淋巴细胞联合甲基化抑制剂5-Aza-CdR对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用。方法:以构建的EBNA1-pCDNA3.1质粒为模板,体外转录获得EBNA1 mRNA,通过脂质体转染至健康人外周血来源DC,构建EBNA1-DC疫苗。流式细胞术检测转染后DC表型及5-Aza-CdR处理后的C666-1细胞凋亡情况。实时无标记动态细胞分析技术检测EBNA1-DC疫苗诱导的淋巴细胞联合5-Aza-CdR的特异性抗肿瘤活性。结果:转染EBNA1 mRNA后EBNA1-DC表面EBNA1阳性率为(59.3±5.85)%,HLA-DR的表达与未转染DC相比显著升高[(84.9±5.5)%vs(68.0±5.8)%,P=0.026],CD80的表达也显著升高([88.2±3.9)%vs(61.1±4.4)%,P=0.015]。低剂量5-Aza-CdR处理后的C666-1细胞凋亡情况与未处理的细胞相比无显著差异。经低浓度5-Aza-CdR预处理的C666-1细胞中IRF7基因表达与未处理的细胞相比显著升高(P=0.0001)。与空载的DC相比,EBNA1-DC诱导的淋巴细胞对EBV阳性表达的C666-1细胞具有更强的特异性杀伤活性(P=0.049);经低浓度5-Aza-CdR预处理的C666-1细胞对EBNA1-DC诱导的特异性免疫杀伤更敏感(P=0.019)。结论:5-Aza-CdR与EBNA1-DC疫苗联合可显著增强对C666-1细胞的特异性免疫杀伤,本研究为开拓以mRNA为基础的DC疫苗及其在临床综合治疗中的应用转化提供前期研究基础。

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中调控核转录因子κB活性研究

为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)的致瘤机制 ,对鼻咽癌细胞中LMP1通过核转录因子κB(NFκB)介导的信号传导途径在鼻咽癌变中的意义进行了研究。利用LMP1受四环素衍生物强力霉素诱导表达的鼻咽癌细胞Tet on LMP1HNE2 ,通过NFκB报道基因分析法、凝胶迁移率分析 (EMSA)及细胞集落形成率等方法 ,结合硫代磷酸反义寡核苷酸阻断技术 ,证实LMP1增强鼻咽癌细胞NFκB的DNA结合活性和反式激活活性 ,这种增强的活性可被LMP1及NFκBp6 5硫代磷酸反义寡核苷酸阻断 ,而NFκBp5 0仅阻断DNA结合活性 ,对反式激活活性无影响。同时 ,LMP1及NFκBp6 5硫代磷酸反义寡核苷酸可部分逆转鼻咽癌细胞的恶性表型 ,而反义 p5 0这种效应不显著。这些结果表明 ,LMP1在鼻咽癌中通过NFκB信号传导途径可能参与了鼻咽癌变 ,NFκBp6 5可能是主要的效应者。

EB 病毒核抗原(EBNA)的表达与大鼠成纤维细胞转化作用的研究

本文应用 Western 印渍和原位免疫荧光定量技术,检测了两株经 EBV-DNABamHI-W(YH)片段转染后转化而建立的细胞株,CH-1和 CH-2所表达的 EBNA 亚型.结果发现,两株细胞均有一系列由27～38KD 小分子量的 EBNA5表达,同时可见 CH-1细胞有低水平的 EBNA2表达.对比起无 EBNA2表达的 CH-2细胞,CH-1细胞具有较低的接触抑制能力和附壁性,并且细胞蛋白质的代谢也有较明显的改变,提示 EBNA2和 EBNA5均与细胞转化有关。

EB病毒核抗原3C提高Gemin3基因的表达

目的探讨EB病毒核抗原(EBNA)3C对Gemin3基因表达的影响。方法共转染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293细胞。依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减EBNA3C基因的表达,并经嘌呤霉素筛选获得稳定的EBNA3C低表达细胞系,采用Western blot检测EBNA3C对Gemin3蛋白表达的影响。结果 Gemin3基因的表达随着EBNA3C表达量的增加而增加,呈剂量依赖性,在EBNA3C基因敲减细胞中Gemin3的表达减少。结论 EBNA3C可提高Gemin3基因表达水平。

EB病毒LMP1抗原肽段LALLFWL对人细胞免疫功能的影响

目的了解EB病毒LMP1抗原肽段LALLFWL对鼻咽癌患者及正常人的细胞免疫功能的影响。方法用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测人外周血单个核细胞(PBMC)在LALLFWL肽段作用后IFN-γ分泌斑点数量,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该肽段与人PBMC一起培养后上清液中IFN-γ的含量。结果鼻咽癌患者及正常人外周血单个核细胞在LALLFWL肽段作用后,其IFN-γ斑点数和含量明显低于无抗原肽段作用的PHA 对照组(P<0.001),在单个细胞水平上,NPC患者分泌IFN-γ能力低于正常人(P<0.05),在培养上清液中,NPC 患者和正常人的IFN-γ浓度差异无显著性(P>0.05)。结论抗原肽段LALLFWL具有降低PBMC分泌IFN-γ的能力,提示该短肽能够抑制细胞免疫功能。

系统性红斑狼疮患者抗Sm抗体与EB病毒核抗原-2表达的相关分析

目的探讨EB病毒(EBV)阳性系统性红斑狼疮(SLE)患者EBV核抗原-2(EBNA2)表达与抗Sm抗体的相关性。方法SLE患者44例,正常人43名作为对照。①采用PCR-Southern杂交技术检测两组外周血单个核细胞中EBV特异性DNA片段,EBV阳性患者进行RT-PCR和Southern杂交检测EBNA2的表达。②ELISA法检测EBV特异性IgM抗体。③免疫印迹法检测血清可提取核抗原(ENA)抗体。结果①SLE组32例EBV阳性,其中EBNA2mRNA阳性20例(活动期9例,稳定期11例),EBNA2mRNA阳性率在活动期和稳定期患者差异无显著性(P>0.05)。②SLE组EBV特异性IgM抗体阳性率为18.18%(8/44),对照组均为阴性,两组有显著性差异(P<0.05)。③SLE抗Sm抗体检出率与EBNA2 mRNA检出率呈正相关(r=0.4107,P<0.05)。结论EBNA2 mRNA表达可能在一定程度上参与SLE的发病和病情进展。

LMP2混合肽负载树突状细胞与EB病毒感染患者外周血单个核细胞共培养产生识别EB病毒抗原的T细胞

LMP2是EB病毒感染细胞后表达的一种蛋白。本研究探讨应用适于不同HLA分型的EB病毒-LMP2抗原混合肽(MIX-LMP2)体外刺激EB病毒感染患者外周血单个核细胞,诱导产生EB病毒抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。取EB病毒相关噬血细胞综合症患者的外周血,分离并诱导培养树突状细胞,在培养过程中用EB病毒MIX-LMP2混合肽刺激,促成熟后在体外激活自体T淋巴细胞,每周刺激1次,共刺激2次;同时对部分分离的淋巴细胞在培养过程中不予以刺激作为对照。用基因扫描T细胞受体(TCR)β基因图谱的方法观察培养前后的T细胞克隆分布变化;用流式细胞术检测T淋巴细胞的表型变化;将培养的细胞和靶细胞共培养检测IFN-γ的分泌以研究CTL细胞抗原特异性的细胞毒作用。研究结果表明,基因扫描TCRβ基因结果显示体外培养改变了患者的TCRβ基因图谱,培养前为寡克隆的TCRβ基因家族在培养后出现与正常人相似的多峰分布,提示淋巴细胞亚群分布恢复正常;流式细胞分析显示培养前的淋巴细胞CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD45RA-CD45RO+比例分别为70.73%、42.99%、27.56%,用负载EB病毒LMP2肽2次刺激体外培养后,上述的淋巴细胞表型分别升高为95.17%、52.54%、81.41%。NK细胞(CD3-CD56+)、调节性T细胞(CD4+CD25+FOXP3+)比例变化不大,分别从培养前的2.12%,0.03%变化为2.35%,0.02%。CD3+CD45RA-CD45RO+细胞增长比例较大,表明2次刺激后大部分的初始型T淋巴细胞被激活。IFN-γ分泌检测结果显示,当负载LMP2肽的DC细胞作为靶细胞时,刺激1次的细胞分泌IFN-γ量和刺激2次的细胞分泌IFN-γ量明显高于同期未刺激细胞分泌IFN-γ量(p<0.05)。而对于未负载LMP2的DC细胞作为靶细胞时,IFN-γ检测结果则显示无统计学意义(p>0.05)。结论:用负载EB病毒MIX-LMP2肽的树突状细胞(DC)刺激T淋巴细胞的培养方法,可以改变患者T淋巴细胞克隆分布,产生识别EB病毒的特异性T淋巴细胞。

EB病毒EBNA1/IgA与鼻咽癌分期的关系

目的:探讨EB病毒EBNA1/IgA抗体与鼻咽癌临床分期的关系。方法:用酶联免疫吸附法(ELISA)检测211例未经治疗的鼻咽癌患者血清中EBNA1/IgA抗体,按"92分期法"进行分期,分别计算各T、N、M分期及临床分期的EBNA1/IgA抗体阳性率及抗体水平并进行统计学分析。结果:鼻咽癌患者的EBNA1/IgA抗体表达与性别和各年龄组没有相关性。EBNA1/IgA抗体rA值与原发灶T分期及颈淋巴结转移N分期差异均有统计学意义(P<0.05);与远处转移M分期差异无统计学意义(P>0.05)。鼻咽癌早期(、期)患者的EBNA1/IgA抗体rA值显著低于晚期(、期)(P<0.05)。结论:EBNA1/IgA抗体在早期鼻咽癌表达水平相对较低。对于评估鼻咽癌临床分期有一定的参考价值。

联合EBNA和Bamh1-W的实时PCR方法检测EB病毒DNA在鼻咽癌中的应用

目的探讨基于EB病毒EBNA基因设计引物的实时PCR在EB病毒DNA检测中的应用以及联合常用方法(Bamh1-W片段)检测在鼻咽癌患者中的诊断价值。方法用两种方法对234例血液标本(包括66例鼻咽癌患者标本)进行EB病毒DNA定量检测,每例样本对细胞内及细胞外分别测定,比较两种方法以及联合检测在各组中的阳性率,观察EBNA法联合Bamh1-W法在鼻咽癌患者中对EB病毒检出率有无提高,方法学的验证采用回归分析及t检验。结果 EBNA法的阳性率(所有样本53.42%,鼻咽癌样本51.52%)低于Bamh1-W法(所有样本69.23%,鼻咽癌样本71.21%),但联合两种方法检测可提高阳性率(所有样本70.94%,鼻咽癌样本72.73%)且在鼻咽癌患者中得到了更大的提高,EBNA法与Bamh1-W法检测标本的相关性R2为0.577,且P<0.05,差异有统计学意义,但在鼻咽癌样本中R2为0.828,相关性较好且P>0.05,差异无统计学意义。结论联合EBNA法和Bamh1-W法检测EB病毒DNA可提高阳性率且在鼻咽癌患者的检测中阳性率能够得到更大的提高,对EB病毒DNA定量和鼻咽癌的辅助诊断具有一定的意义。

EB病毒阳性的不同类型淋巴瘤组织中EBNA1多态性研究

目的:筛选前期研究中EB病毒(EBV)阳性的15例不同类型淋巴瘤病例,对这15例EBV阳性病例进行PCR扩增及EBV核抗原1(EBNA1)羧基端测序分析,观察是否存在突变热点AA487及AA466-527之间的变异。方法:采用PCR方法对EBV阳性病例进行EBNA1基因羧基端的扩增,并将扩增产物送公司进行测序分析。同时分析淋巴瘤患者EBV表达与预后的相关性。结果:本次实验成功扩增15例病例,进行EBNA1基因羧基端测序分析发现,15例标本中EBNA1羧基端均出现序列变异,其中以往报道过的突变有:错义突变AA487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V和533 L→I,无义突变为AA520密码子cat→ctc;本次研究新发现的突变有:错义突变AA462 G→E、466 G→R、AA487 A→L、492 S→C、502 T→N和524 T→I及无义突变AA466密码子gga→gaa、AA 480密码子aac→atc和AA 547密码子ccc→cct突变。几例非肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤病例也均出现了与以往研究相同的共有突变;而肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤样本中除了有部分共有突变外,均出现了非共有突变。结论:本组淋巴瘤病例中,除了有部分EBNA1基因羧基端的共有突变外,均出现了非共有突变,这与以往研究不同。

鼻咽癌病人和正常人群中EB病毒特异性T细胞对靶抗原的识别和应答

为探讨痘苗病毒表达的Epslein Barr病毒 (EBV)核抗原 1、4(EBNA1、4)和潜伏膜蛋白 1、2 (LMP1、2 ) ,在不同人群的特异性T细胞引起的特异性T细胞杀伤 (CTL)中的作用 ,采集EBV阴性正常人、未经治疗的鼻咽癌 (NPC)病人和EBV IgA/VCA阳性者各 10人的周围血淋巴单核细胞 (PBMC) ,用EBV转化B淋巴细胞 ,建立类淋巴母细胞 (LCL)。用LCL刺激自体的T淋巴细胞作为效应细胞 ,以LCL感染重组痘苗病毒表达的EBNA1、4和LMP1、2为靶细胞 ,以51Cr释放法检测EBV特异性CTL所识别的靶抗原。结果表明 ,EBV LMP1、2可能既是EBV特异性T细胞的刺激抗原 ,又是其识别的靶抗原。将采集的 30例试验者的各 5株单克隆T细胞株分别检测HLA Ⅰ型(A、B、C) ,按照不同型别寻找相对应的EBNA1、4和LMP1、2的不同合成肽 ,应用酶免疫吸附斑点法 (Elispot)检测EBV特异性CD8+ 的CTL应答。结果显示 :10例正常人中 9人有特异的LMP2应答 ,4人有特异的EBNA4应答 ;10例未治疗的NPC病人中 3人有特异的LMP2 ,2人有特异的EBNA1,3人有特异的EBNA4应答 ;在 10例EBV-IgA/VCA阳性中 ,6人有特异的LMP2 ,5人有特异的EBNA4应答。