泛素与EB病毒核抗原1融合基因的DNA免疫研究

构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)基因的表达质粒pCI-EBNA1和泛素(ubiquitin,Ub)与EBNA1融合基因的表达质粒pCI-Ub-EBNA1。间接免疫荧光和Westernblot分析表明,两重组质粒转染HeLa细胞后均能瞬时表达。两种质粒DNA肌肉注射免疫Balb/C小鼠后,分别检测小鼠血清抗EBNA1的抗体和特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较单基因与融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果显示:二者诱生抗体的效率无明显差别,但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强。

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 。

多层螺旋CT增强扫描联合血清免疫球蛋白A/EB病毒壳抗原水平检测在鼻咽癌诊断中的应用价值

目的分析多层螺旋CT(MSCT)增强扫描联合血清免疫球蛋白A/EB病毒壳抗原(VCA-IgA)水平检测在鼻咽癌诊断中的应用价值。方法选取2012年5月至2018年12月黄河中心医院收治的124例疑似鼻咽癌患者作为研究对象,术后最终经鼻咽部病理活检确诊的患者作为观察组(n=76),鼻咽部良性病变的患者作为对照组(n=48)。术前均实施MSCT增强扫描及血清VCA-IgA检查。比较两组血清VCA-IgA阳性率及MSCT增强扫描阳性率、病理分化阳性检出情况及诊断灵敏度、特异度、准确度。结果观察组MSCT增强扫描阳性率、血清VCA-IgA阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。未分化型非角化性鼻咽癌血清VCA-IgA阳性检出率高于分化型非角化性鼻咽癌,差异有统计学意义(P<0.05);分化型非角化性鼻咽癌MSCT增强扫描、两者联合阳性检出率与分化型非角化性鼻咽癌比较,差异无统计学意义(P>0.05)。联合诊断敏感度、准确度高于血清VCA-IgA、MSCT增强扫描单一检测诊断结果,差异有统计学意义(P<0.05);血清VCA-IgA、MSCT增强扫描联合诊断特异度与两者单一诊断比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论MSCT增强扫描联合血清VCA-IgA水平检测能进一步提高诊断敏感度,可为鼻咽癌临床治疗提供参考依据。

单免疫球蛋白-白介素1受体蛋白在原发性EB病毒感染肝损伤患儿血清中的表达及临床意义

目的探讨单免疫球蛋白-白介素1受体蛋白(SIGIRR)在原发性EB病毒感染肝损伤患儿血清中的表达及临床意义。方法选取40例原发性EB病毒感染患儿(入院时EB-IgM和EB-DNA检测均阳性)为A组,门诊体检EB-IgG阳性(EB-VCA-IgG、EB-NA-IgG)而EB-IgM阴性的40例儿童为B组,门诊体检EB-IgG和EB-IgM均阴性的40例儿童为C组。检测并比较A组入院时及治疗1周后血清SIGIRR表达水平及AST、ALT水平,比较3组对象血清SIGIRR表达水平,同时分析A组入院时及治疗1周后血清SIGIRR表达水平与ALT水平的相关性。结果治疗1周后,原发性感染患儿血清SIGIRR表达水平明显升高,ALT水平明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);而AST水平变化不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。A组入院时血清SIGIRR表达水平与B、C组的差异有统计学意义(P<0.05),治疗1周后与B、C组的差异无统计学意义(P>0.05)。原发性感染患儿入院时血清ALT水平明显升高,与血清SIGIRR表达水平呈负相关(r=-0.806,P<0.05),治疗1周后两者未见相关性(r=0.106,P>0.05)。结论EB病毒感染后患儿血清SIGIRR表达水平明显降低,与ALT水平相关,是肝损伤的保护因子。

干扰素α-1b联合人免疫球蛋白对EB病毒感染患儿临床疗效及对Ficolin-3、SH2D1A表达的影响

目的探讨人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白治疗对EB病毒(EBV)感染患儿的临床疗效,并分析治疗对患儿免疫相关分子纤维胶凝蛋白3(Ficolin-3)、SH2结构域蛋白1A(SH2D1A)表达水平的影响。方法选取2018年2月至2020年2月在该院就诊的130例EBV感染患儿,根据治疗方式不同分为对照组和观察组,各65例。对照组给予常规治疗,观察组在常规治疗基础上给予人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白治疗。观察两组发热、咳嗽、颈淋巴结肿大、咽痛、扁桃体肿大和肝脾肿大各项临床症状的消失时间。采用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测治疗前后两组EBV-DNA、EBV-CA-IgM及EBV-NA-IgG,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组治疗前后血清Ficolin-3、SH2D1A水平,以及外周血白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,采用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)。结果观察组发热、咳嗽、颈淋巴结肿大、咽痛、扁桃体肿大和肝脾肿大各项临床症状的消失或消退时间均短于对照组,EBV-DNA、EBV-CA-IgM转阴率均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与治疗前比较,治疗后两组Ficolin-3、SH2D1A、IL-6、IL-8、TNF-α、CD8^(+)明显降低,CD3^(+)、CD4^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗前Ficolin-3、SH2D1A表达与IL-6、IL-8、TNF-α及CD8^(+)呈正相关(r=0.478、0.454、0.503,0.462、0.443、0.511,均P<0.001),与CD3^(+)、CD4^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)呈负相关(r=-0.567、-0.402、-0.423,-0.477、-0.416、-0.409,均P<0.001)。观察组治疗总有效率[96.92%(63/65)]明显高于对照组[80.00%(52/65)],差异有统计学意义(χ^(2)=9.119,P=0.003),并发症总发生率[9.23%(6/65)]明显低于对照组[30.77%(20/65)],差异有统计学意义(χ^(2)=9.423,P=0.002)。结论干扰素α-1b联合人免疫球蛋白能降低EBV感染患儿Ficolin-3、SH2D1A水平,改善患儿免疫功能,提高治疗有效性。

论干扰素α-1b与人免疫球蛋白联合调节EB病毒感染患儿有效率与炎症的观察

探究干扰素α-1b与人免疫球蛋白联合调节EB病毒(EBV)感染患儿有效率。方法 回顾性分析我院收治的EB病毒感染患儿临床资料,并从中摘取60例进行此次研究,摘取时间从2017年2月起,直至2023年2月止,以随机电脑数字表法将患儿分成例数相等的两组,即对照组(n=30例,采取常规治疗)和观察组(n=30例,实施干扰素α-1b与人免疫球蛋白联合治疗),后方分析组间患儿淋巴结肿大消退时间等指标的差异,以及其他相关指标之间的差异。结果 ①对照组患儿的康复指标明显不如观察组,组间差异具备显著统计学意义(P<0.05)。②观察组患儿的EBV-DNA、EBV-CA-IgM病毒转阴率显著高于对照组,组间差异之大被视为统计学意义(P<0.05),但是两组的EBV-NA-IgG转阴率差异不明显(P>0.05)。③观察组患儿的炎症因子水平显著低于参照组,组间差异视为有统计学意义(P<0.05)。④对照组的并发症发生率显著低于观察组,组间差异大,视为统计学差异(P<0.05)。结论 干扰素α-1b与人免疫球蛋白联合能快速消除患者的不适体征,降低患儿体内炎症因子的水平,感染EB病毒患儿的转阴率提高,并发症发生率降低。因此患儿免疫功能得到改善,治疗效果有明显提升。

V-val突变型EB病毒核抗原1的功能研究

背景与目的:EB病毒核抗原1(Epstein-Barr viral nuclear antigen 1,EBNA 1)对于维持EB病毒的潜伏感染有重要作用。V-val变异型的EBNA1与鼻咽癌有密切的相关性。本研究旨在比较原型和V-val变异型的EBNA1基因在上皮细胞中的功能的差异。方法:用PCR方法扩增出原型和V-val变异型EBNA1基因的全长并克隆到pGFP载体上,转染HEK293细胞,检测两种亚型的EBNA1蛋白的表达对细胞生物学性状的影响。以含有EB病毒增强子FR序列的荧光素酶载体作为报告基因,比较两种亚型的EBNA1基因对质粒的转录激活能力。结果:原型和V-val变异型EBNA1基因的表达对HEK293细胞的生长速度没有明显影响,但表达原型EBNA1的细胞的克隆形成能力明显低于V-val亚型。在裸鼠致瘤实验中,接种表达原型和V-val变异型EBNA1细胞的实验组均未见肿瘤形成。但是在瞬时转染实验中,表达V-val变异型EBNA1基因的HEK293细胞的荧光素酶活性明显高于原型EBNA1基因。结论:原型和变异型EBNA1均未发现有明显的转化细胞的能力,但是V-val变异型EBNA1蛋白与原型相比,其转录激活的功能明显增强。

EB病毒LMP1抗原肽段LALLFWL对人细胞免疫功能的影响

目的了解EB病毒LMP1抗原肽段LALLFWL对鼻咽癌患者及正常人的细胞免疫功能的影响。方法用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测人外周血单个核细胞(PBMC)在LALLFWL肽段作用后IFN-γ分泌斑点数量,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该肽段与人PBMC一起培养后上清液中IFN-γ的含量。结果鼻咽癌患者及正常人外周血单个核细胞在LALLFWL肽段作用后,其IFN-γ斑点数和含量明显低于无抗原肽段作用的PHA 对照组(P<0.001),在单个细胞水平上,NPC患者分泌IFN-γ能力低于正常人(P<0.05),在培养上清液中,NPC 患者和正常人的IFN-γ浓度差异无显著性(P>0.05)。结论抗原肽段LALLFWL具有降低PBMC分泌IFN-γ的能力,提示该短肽能够抑制细胞免疫功能。

EB病毒核抗原1羧基端原核表达产物的纯化方法

EB病毒核抗原 1羧基端的原核表达产物以包涵体和可溶性两种形式存在,用镍离子亲和柱分别对其进行了纯化。结果显示,可溶性部分以及经 2M尿素溶解后的包涵体的最适咪唑洗脱浓度均为 150mM。纯化后重组蛋白的纯度在 90%以上。

EB病毒诱发淋巴瘤中EB病毒核抗原-1的表达

目的:检测EB病毒(EBV)诱导正常人淋巴细胞发生肿瘤前后EB病毒核抗原-1(EBNA-1)的差异表达情况,为研究EBV诱发淋巴瘤的发生机制提供实验依据。方法:构建SCID小鼠体内EBV诱发淋巴瘤的动物模型,分别采用实时定量PCR和Western blot方法检测EBNA-1基因的表达情况。结果:成功复制EBV诱发淋巴瘤动物模型,EBNA-1基因在6例"正常人"淋巴细胞和3例诱发淋巴瘤细胞中均有表达,在诱发淋巴瘤细胞中的表达比在正常人淋巴细胞中的表达上调11 683倍,差异有统计学意义。Western blot结果显示,与正常人淋巴细胞组相比,EBNA-1在诱发淋巴瘤细胞的蛋白表达明显升高。结论:EBV诱发淋巴瘤中EBNA-1的表达上调,EBNA-1在EB病毒诱发淋巴瘤的形成过程中可能起重要作用。

EB 病毒核抗原(EBNA)的表达与大鼠成纤维细胞转化作用的研究

本文应用 Western 印渍和原位免疫荧光定量技术,检测了两株经 EBV-DNABamHI-W(YH)片段转染后转化而建立的细胞株,CH-1和 CH-2所表达的 EBNA 亚型.结果发现,两株细胞均有一系列由27～38KD 小分子量的 EBNA5表达,同时可见 CH-1细胞有低水平的 EBNA2表达.对比起无 EBNA2表达的 CH-2细胞,CH-1细胞具有较低的接触抑制能力和附壁性,并且细胞蛋白质的代谢也有较明显的改变,提示 EBNA2和 EBNA5均与细胞转化有关。

鼻咽癌病人和正常人群中EB病毒特异性T细胞对靶抗原的识别和应答

为探讨痘苗病毒表达的Epslein Barr病毒 (EBV)核抗原 1、4(EBNA1、4)和潜伏膜蛋白 1、2 (LMP1、2 ) ,在不同人群的特异性T细胞引起的特异性T细胞杀伤 (CTL)中的作用 ,采集EBV阴性正常人、未经治疗的鼻咽癌 (NPC)病人和EBV IgA/VCA阳性者各 10人的周围血淋巴单核细胞 (PBMC) ,用EBV转化B淋巴细胞 ,建立类淋巴母细胞 (LCL)。用LCL刺激自体的T淋巴细胞作为效应细胞 ,以LCL感染重组痘苗病毒表达的EBNA1、4和LMP1、2为靶细胞 ,以51Cr释放法检测EBV特异性CTL所识别的靶抗原。结果表明 ,EBV LMP1、2可能既是EBV特异性T细胞的刺激抗原 ,又是其识别的靶抗原。将采集的 30例试验者的各 5株单克隆T细胞株分别检测HLA Ⅰ型(A、B、C) ,按照不同型别寻找相对应的EBNA1、4和LMP1、2的不同合成肽 ,应用酶免疫吸附斑点法 (Elispot)检测EBV特异性CD8+ 的CTL应答。结果显示 :10例正常人中 9人有特异的LMP2应答 ,4人有特异的EBNA4应答 ;10例未治疗的NPC病人中 3人有特异的LMP2 ,2人有特异的EBNA1,3人有特异的EBNA4应答 ;在 10例EBV-IgA/VCA阳性中 ,6人有特异的LMP2 ,5人有特异的EBNA4应答。

EB病毒核抗原1结合蛋白2对肝癌细胞的影响

目的探讨EB病毒核抗原1结合蛋白2(EBP2)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达水平,并分析EBP2对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法获取来自癌症基因组图谱数据库的HCC患者mRNA表达数据及相应的临床信息,共涵盖371例HCC样本和50例癌旁正常肝组织样本。分析EBP2基因的表达水平。设计针对EBP2的短发夹RNA(shRNA)序列,将他们克隆到慢病毒载体质粒中,作为敲减质粒;同时构建含有非特异性shRNA的阴性对照质粒。将这些质粒分别转染SMMC7721和BEL-7404细胞,用于构建EBP2敲减组细胞(SMMC7721sh-EBP2组、BEL-7404sh-EBP2组)和各自的阴性对照组细胞(SMMC7221sh-Ctrl组、BEL-7404sh-Ctrl组)。采用细胞计数实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验等检测EBP2基因敲减对肝癌细胞的影响。结果EBP2在HCC肿瘤样本中的表达水平高于正常样本(2.256±0.312比1.362±0.341),差异具有统计学意义(t=7.85,P<0.001)。与SMMC7221sh-Ctrl组相比,SMMC7721sh-EBP2组肝癌细胞增殖活性(1.28±0.03比2.33±0.05)、形成集落的数量[(86.78±12.69)个比(194.54±14.82)个]、侵袭细胞数[(104.78±12.26)个比(224.18±9.57)个]以及迁移能力[(0.13±0.01)%比(0.24±0.01)%]均降低,差异均具有统计学意义(均P<0.001)。与BEL-7404sh-Ctrl组相比,BEL-7404sh-EBP2组肝癌细胞活性(1.08±0.04比1.97±0.06)、形成集落的数量[(90.94±10.49)个比(185.36±11.03)个]、侵袭细胞数[(94.39±11.25)个比(198.66±10.14)个]以及迁移能力[(0.15±0.01)%比(0.38±0.01)%]均降低,差异均具有统计学意义(均P<0.001)。结论EBP2在HCC癌组织中高表达,EBP2敲减可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

16873例体检人群中EB病毒VCA/IgA的调查

目的观察EB病毒壳抗原/免疫球蛋白A(VCA/IgA)在本地人群中的分布。方法用免疫酶法检测16 873例柳州体检人群的EB病毒VCA/IgA,并与其它地区进行比较。结果VCA/IgA1:10阳性者2 620例,阳性率为15.5%,其中女性阳性率为15.1%(1 295/8 581),男性阳性率为16.0%(1 325/8 292)。结论柳州地区的EB病毒VCA/IgA阳性率高于其它地区,而从事烟草行业的人群EB病毒检出率又明显高于其它行业,应加强对EB病毒的监测。

EB病毒阳性的不同类型淋巴瘤组织中EBNA1多态性研究

目的:筛选前期研究中EB病毒(EBV)阳性的15例不同类型淋巴瘤病例,对这15例EBV阳性病例进行PCR扩增及EBV核抗原1(EBNA1)羧基端测序分析,观察是否存在突变热点AA487及AA466-527之间的变异。方法:采用PCR方法对EBV阳性病例进行EBNA1基因羧基端的扩增,并将扩增产物送公司进行测序分析。同时分析淋巴瘤患者EBV表达与预后的相关性。结果:本次实验成功扩增15例病例,进行EBNA1基因羧基端测序分析发现,15例标本中EBNA1羧基端均出现序列变异,其中以往报道过的突变有:错义突变AA487 A→V、499 D→E、502 T→N、524 T→I、528 I→V和533 L→I,无义突变为AA520密码子cat→ctc;本次研究新发现的突变有:错义突变AA462 G→E、466 G→R、AA487 A→L、492 S→C、502 T→N和524 T→I及无义突变AA466密码子gga→gaa、AA 480密码子aac→atc和AA 547密码子ccc→cct突变。几例非肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤病例也均出现了与以往研究相同的共有突变;而肿瘤细胞EBER阳性的淋巴瘤样本中除了有部分共有突变外,均出现了非共有突变。结论:本组淋巴瘤病例中,除了有部分EBNA1基因羧基端的共有突变外,均出现了非共有突变,这与以往研究不同。

干扰素α-1b与人免疫球蛋白对EB病毒感染患儿临床症状消失时间及免疫功能的影响

分析干扰素α-1b与人免疫球蛋白对EB病毒(EBV)感染儿童临床症状消失时间及免疫功能的影响。方法 研究对象:我院于2021-01至2022-01收治的62例EBV感染患儿,以抽签法分组,各31例,对照组:人免疫球蛋白治疗,观察组:干扰素α-1b结合人免疫球蛋白治疗,对比治疗效果。结果 观察组患儿临床各项症状缓解所用时间较低(P<0.05);免疫功能指标水平较高(P<0.05);治疗后,观察组EBV-DNA阳性率、EBV-CA-IgMA阳性率较低(P<0.05);观察组患儿治疗后EBV-NA-IgGA阳性率较低,但组间对比(P>0.05)。结论 针对EBV感染患儿以干扰素α-1b结合人免疫球蛋白治疗,能够有效缩短患儿症状消失时间、促进身体恢复,在一定程度上对提高机体免疫功能、促使病毒尽快转阴具有积极影响。

EB病毒相关胃癌免疫治疗的研究进展

EB病毒相关胃癌(EBVaGC)是一种具有独特病理特征的胃癌亚型,具有高表达免疫检查点蛋白和高淋巴细胞浸润特性。因此,免疫疗法有望成为EBVaGC新的治疗策略。免疫检查点阻断疗法是目前研究最多的一种免疫治疗手段,如程序性细胞死亡受体1(PD-1)/程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂。目前,治疗EBVaGC的PD-1/PD-L1抑制剂有Avelumab、Pembrolizumab、Nivolumab、Toripalimab、Camrelizumab等,CTLA-4抑制剂有Ipilimumab、Tremelimumab。除此之外,还有利用STING、BARF1、MHC、CXCL8、NK细胞等分子或细胞的免疫治疗手段。但免疫疗法治疗EBVaGC的临床研究尚少,其具体疗效还有待于进一步验证。

鼻咽癌患者血清EB病毒Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗体与其临床表现的关系

目的探究鼻咽癌患者血清EB病毒(EBV)Rta蛋白免疫球蛋白G抗体(Rta-IgG)、壳抗原免疫球蛋白A抗体(VCA-IgA)、早期抗原免疫球蛋白A抗体(EA-IgA)与其临床表现的关系。方法选取2016年3月-2018年10月我院经病理活检证实的鼻咽癌患者164例为鼻咽癌组,同期就诊的鼻炎疾病(非鼻咽癌)患者61例为鼻咽疾病组、健康体检者72例为健康对照组。比较3组血清Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗体阳性率差异,并分析血清Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗体与鼻咽癌患者临床表现的关系。结果鼻咽癌组血清Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗体阳性率显著高于鼻咽疾病组及健康对照组(P<0.05),鼻咽疾病组与健康对照组血清Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗体阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同性别、年龄及T分期鼻咽癌患者血清Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗体水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同N分期、不同M分期鼻咽癌患者血清Rta-IgG抗体水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。临床分期Ⅰ期鼻咽癌患者血清Rta-IgG抗体水平明显低于临床分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期者(P<0.05),但临床分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者血清Rta-IgG抗体水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。鼻咽癌患者血清VCA-IgA、EA-IgA抗体水平均随N分期、M分期及临床分期的升高而升高(P<0.05)。结论血清Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗体水平与鼻咽癌临床表现有一定相关性,可应用于鼻咽癌的诊疗。