过表达EB病毒潜伏期膜蛋白1(LMP1)的人B淋巴细胞株的建立

目的构建EB病毒潜伏期膜蛋白1(LMP1)基因的真核表达载体,通过电穿孔法转染人B淋巴瘤细胞株Ramos细胞,建立稳定的LMP1表达细胞株。方法扩增带有EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点的LMP1编码基因,克隆至pcDNA3.1-EF1a-mcs-3FLAG-CMV-EGFP真核表达载体,挑取阳性单克隆感受态细胞行PCR以及测序后将重组质粒通过电穿孔法转染Ramos细胞, G418筛选稳定表达LMP1的细胞株, PCR和Western blot法分别检测LMP1 mRNA和蛋白在Ramos细胞中的表达。结果 PCR与测序证实成功构建了LMP1重组质粒,建立了稳定转染的Ramos细胞,且LMP1蛋白可在细胞中成功表达。结论成功建立了稳定表达LMP1的Ramos细胞。

EB病毒潜伏期膜蛋白1与自身免疫性疾病关系的研究进展

目的已经证实多种自身免疫性疾病和血液病均与EB病毒(EBV)感染有关,其中EBV潜伏期膜蛋白1(LMP 1)基因是EBV的关键致瘤基因,也是使EBV在人体内维持潜伏感染的重要片段。LMP1在感染过程中参与多种细胞通路的改变与多种细胞因子的调节,其对细胞的诸多调控作用导致了多种自身免疫性疾病的发生发展。本文主要综述EBV的感染特点及LMP1在自身免疫性疾病中参与的发病机制。

鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1活化cyclinD1的表达

为了探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(EBV LMP1)促进细胞增殖 ,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制 ,研究了LMP1在鼻咽癌细胞中调节cyclinD1表达 ,进而影响细胞周期行进及细胞恶性表型改变 ,并初步确定了LMP1发挥该功能的结构域 .利用已建株的Tet on LMP1 HNE2鼻咽癌细胞系 ,蛋白质印迹实验分析LMP1诱导cyclinD1蛋白质表达的表达动力学 ,包括时间效应及剂量效应 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,确定LMP1活化cyclinD1表达的结构域 .同时结合基因诱导表达及反义寡聚核酸技术阻断基因表达的实验方法 ,进一步确定LMP1上调的cyclinD1功能 ,即对细胞周期行进及细胞恶性表型的影响 .结果表明LMP1确实可以诱导cyclinD1的表达 (2～ 4倍 ) ,且诱导具有时间依赖性及剂量依赖性 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,结合报道基因分析法 ,确定与空白载体细胞系比较 ,野生型LMP1从转录水平可反式激活cyclinD1报道基因活性约 11 2倍 ,其中CTAR1及CTAR2均可活化cyclinD1表达 ,但以CTAR2为主 ,与野生型LMP1诱导cyclinD1反式激活活性比较 ,CTAR1缺失导致cyclinD1报道基因活性下降 2 3 6 % ,CTAR2缺失导致cyclinD1活性下降约 80 7% ,C端均缺失时cyclinD1活性只?

EB病毒潜伏膜蛋白1通过TRAF/TRADD激活JNK信号途径

为了探讨在鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)激活c Jun氨基端激酶 (JNK)信号途径的分子机制 ,利用可调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系L7,蛋白质印迹检测 ,发现LMP1能够促进JNK的活化 ;利用稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2 LMP1及其三种突变体HNE2 LMP1ΔCTAR 1、HNE2 LMP1ΔCTAR2、HNE2 LMP1ΔCTAR 1,2及LMP1阴性的HNE2 为材料 ,采用蛋白质印迹和报告基因法分析JNK和活化蛋白 1(AP1)活化情况 ,结果显示HNE2 LMP1和HNE2 LMP1ΔCTAR1中磷酸化JNK蛋白表达量和AP1活性都无显著差异 ,而与HNE2 LMP1ΔCTAR2、HNE2 LMP1ΔCTAR1,2、阴性对照HNE2及空白载体转染细胞的JNK蛋白表达和AP1活性具有显著差异 ;进一步比较转染TRAF、TRADD显性负性突变体鼻咽癌细胞系HNE2 LMP1中磷酸化的JNK量和AP1活性 ,结果显示 :TRAF DN和TRADD DN的导入使活化的JNK蛋白和AP 1活性显著降低 ,二者间无显著差异 ,提示TRAF和TRADD可能参与了LMP1对JNK和AP 1的活化 .以上结果提示在鼻咽癌细胞系中LMP1功能结构域CTAR2通过结合TRAF/TRADD激活JNK从而活化重要的转录因子AP1.

EB病毒编码的潜伏膜蛋白1参与鼻咽癌恶性演进的转录调控实验研究

探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)激活激活蛋白 1(AP1) ,和核转录因子 (NF κB)在鼻咽癌细胞SUNE 1及亚细胞株恶性演进中的作用 .运用报告基因法和凝胶电泳迁移率法 (EMSA)分析AP1和NF κB反式激活活性和DNA结合活性 ,蛋白质印迹检测蛋白质表达 ;裸鼠致瘤实验结合组织制片研究瘤细胞的成瘤和转移能力 .结果显示恶性程度不同的SUNE 1亚细胞株的反式激活活性、DNA结合活性、LMP1蛋白表达及c Jun氨基端激酶 (JNK)活性均存在明显差异 ,且与细胞恶性程度正相关 .这些结果提示LMP1活化AP1和NF κB的信号通路参与了鼻咽癌细胞SUNE 1的恶性演进过程 .

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌细胞中通过STAT3促进VEGF表达

探讨了EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)是否通过STAT3调控诱导血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的表达 .利用蛋白质印迹的方法对HNE2、HNE2 LMP1以及瞬时转染STAT3显性负性突变体STAT3β的HNE2 LMP1细胞中VEGF含量进行检测 ,发现LMP1可以上调VEGF的表达 ,而STAT3β可以抑制VEGF的上调 ;利用LMP1可控表达细胞系tet on LMP1 HNE2进行LMP1时间和剂量诱导表达研究 ,发现VEGF可以随LMP1的动态表达而表达 ;将VEGF野生型报告基因和VEGF潜在的STAT3转录因子突变体报告基因与LMP1表达载体分别共转染研究发现 ,LMP1可以激活VEGF的转录 ,这种转录通过VEGF启动子区STAT3转录因子的结合位点发挥作用 ;电泳迁移率变动分析 (EMSA)确证了STAT3的这种DNA位点的特异性活性 .结果表明 :EB病毒编码的LMP1在鼻咽癌细胞中可以增加VEGF的转录和表达 。

EB病毒潜伏膜蛋白1通过Survivin介导细胞增殖和抑制细胞凋亡

利用间接免疫荧光、基因转染、抗体剔除 (Ab knock out)、细胞平板集落形成、流式细胞术以及半胱氨酸天冬酰胺酶 (caspase3)活性检测等方法 ,从survivin核移位、Rb磷酸化、细胞周期演进、细胞克隆形成和细胞凋亡等方面 ,探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)调控细胞增殖和细胞凋亡双重效应的分子机制 .结果发现 ,LMP1表达介导survivin核移位 ,促进细胞Rb磷酸化增加 ,S期细胞数显著增加 ;LMP1通过survivin促进细胞克隆形成 .用Ab knock out阻断survivin核移位和survivin反义核酸抑制survivin表达时 ,Rb磷酸化水平降低 ,S期细胞减少 ,抑制LMP1介导的细胞增殖 ,活化细胞caspase 3,诱导细胞凋亡 .结果提示 。

EB病毒潜伏膜蛋白1多态性与鼻咽癌的关系

为了分析广东地区鼻咽癌病人和非鼻咽癌病人携带的Epstein Barr病毒 (EBV)潜伏膜蛋白 1(LMP1)基因多态性 ,探讨LMP1基因羧基端缺失 30个碱基的EBV是否与华南地区鼻咽癌高发有关。为此收集了初治的 10 7例鼻咽癌病人和 10 6例非鼻咽癌肿瘤病人的漱口液 ,用巢式PCR扩增LMP1羧基端 ,观察缺失型LMP1的构成比。同时 ,测序分析缺失型LMP1编码区序列 ,了解缺失型LMP1多态性与鼻咽癌的关联度。结果 :在 5 0 %的样品中可检出LMP1基因 ,缺失型LMP1在鼻咽癌病人和非鼻咽病人的构成比相似 ,约占 70 % ,原型和缺失型LMP1混合感染少见 (0～ 6 % )。另外 ,广州地区的缺失型LMP1序列与上海、台湾、香港地区的缺失型LMP1基因高度同源 ,鼻咽癌病人是和非鼻咽癌病人携带的缺失型LMP1基因序列基本相同。此结果表明 ,广州地区流行的LMP1基因羧基端缺失 30个碱基的EBV株 ,漱口液中检测出的缺失型与原型LMP1构成比约为 7:3,在鼻咽癌病人和非鼻咽癌病人此分布情况相似。

重组腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞影响的动物试验

目的探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定最佳转染复数(MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下制作鼻咽癌异位肝种植的肝肺转移模型,观察肝脏成瘤及肝内、肺转移情况,分析LMP-1基因沉默在动物水平对鼻咽癌细胞成瘤及转移能力的影响。结果rAAV-EGFP以5×104v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×104v.g/细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90%,动物试验结果显示rAAV-shRNA-LMP-1组肝脏成瘤体积与对照组rAAV-EGFP无显著差异,但显著减少了种植肿瘤的肝内及肺转移率。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,可在动物水平抑制鼻咽癌细胞转移,但对鼻咽癌细胞生长无显著影响。

应用RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白-1表达对鼻咽癌细胞生长的影响(英文)

目的探讨能否通过siRNA人工诱导RNA干扰,在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C611中,选择性抑制潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达,并了解LMP1抑制对鼻咽癌细胞生长的影响。方法利用脂质体转染的方法,将人工合成的双链siRNA导入鼻咽癌细胞,通过半定量RT-PCR检测LMP1 mRNA水平的变化。并采用MTT法和流式细胞仪检测LMP1表达抑制后,鼻咽癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果C611细胞转染siRNA可使LMP1 mRNA水平下降90%以上。LMP1基因抑制后,C611细胞增殖速度下降33%;流式细胞检测显示,C611细胞周期在G0-G1期受阻。结论本研究证明,全新的人工诱导RNA干扰技术,能够有效抑制LMP1基因的表达,并降低鼻咽癌细胞的增殖能力,为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。

EB病毒潜伏膜蛋白1通过结合TRAFs调控NF-κB

为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)的致瘤机制 ,对鼻咽癌中LMP1激活重要的核转录因子NF κB机制进行了研究 .首先 ,采用免疫共沉淀 蛋白质印迹在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2 LMP1中证实LMP1与TRAF1,2 ,3结合形成免疫共沉淀复合物 ,进一步以野生型LMP1及其三种突变体的鼻咽癌细胞系LMP1(野生型 ,wt)、HNE2 LMP1del187～ 35 1(CTAR1缺失型 )、HNE2 LMP1(1～ 2 31) (CTAR2缺失型 )、HNE2 LMP1(1～ 187) (羧基端胞浆区缺失型 )、HNE2 pSG5 (空白载体型 )为材料 ,结合NF κB报道基因质粒(pGL2 NF κB luc)的荧光素酶活性表达分析NF κB的活性 ,证实 :较之母细胞 ,野生型LMP1活化NF κB达13 8倍 ,LMP1(1～ 187)几乎不活化NF κB ,LMP1(1～ 2 31)活化NF κB达 4 9倍 ,LMP1(del187～ 35 1)活化NF κB达 9 1倍 ;TRAF1过表达升高LMP1(wt)及LMP1(1～ 2 31)介导的NF κB活性 ,而对LMP1(del187～ 35 1)活化NF κB无影响 ;TRAF3过表达或TRAF3负显性突变体抑制LMP1(wt)及LMP1(1～ 2 31)介导的NF κB活性 ,而不影响LMP1(del 187～ 35 1)活化NF κB ;TRAF2过表达升高LMP1(wt)、LMP1(1～2 31)及LMP1(del 187～ 35 1)介导的NF κB活性 .这些结果表明 :鼻咽癌中LMP1通过TRAF1、TRAF2或TRAF3调控NF κB 。

EB病毒潜伏性膜蛋白1促原代MEF细胞永生化的作用及机制

为了探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)促原代小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞增殖规律及作用机制,构建包含野生型LMP1和其TNFR相关死亡区(TRADD)结合区即羧基末端384～386氨基酸置换(YYD→ID)的突变型LMP1逆转录病毒,感染原代培养的MEF细胞,动态观察各细胞在传代培养过程中细胞动力学和形态学变化。发现对照细胞(MEF-LNSX)传至P8～P10时出现明显的生长阻滞;携突变型LMP1的细胞(MEF-LMP1TRADD)自P10起倍增时间逐渐延长,P19时出现明显生长阻滞;而携野生型LMP的细胞(MEF-LMP1)倍增时间逐渐降低并发生了永生化。Westernblot检测发现MEF-LNSX细胞CyclinA表达自P4起明显降低,MEF-LMP1TRADD细胞自P10显著增高后快速降低,MEF-LMP1自P10显著增高后一直维持在较高水平。结果表明:LMP1能促进MEF细胞增殖并诱导体外永生;LMPTRADD则仅能诱导MEF细胞的早期增殖。提示羧基末端区(TRADD)是LMP1促MEF细胞永生的重要活性部位,上调CyclinA表达可能是其作用机制之一。

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌细胞中通过ERK介导Ets-1表达

为了探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)对核转录因子Ets 1表达和活化的影响 ,并证实细胞外信号调节激酶 1/ 2 (ERK1/ 2 )参与了该过程 ,选用可调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系L7,应用蛋白质印迹法检测Ets 1、p ERK蛋白质表达 ,免疫共沉淀 蛋白质印迹法检测Ets 1磷酸化状态 ,使用ERK1/ 2特异性小分子阻断物PD980 5 9作用后 ,蛋白质印迹法检测 p ERK、Ets 1表达及磷酸化变化 .结果显示 :在L7细胞中诱导性LMP1可促进p ERK、Ets 1蛋白质表达及其苏氨酸残基磷酸化 ,在一定范围呈时间和剂量效应 ;通过PD980 5 9对诱导性LMP1作用的干预发现 ,p ERK大部分表达被阻断 ,而Ets 1表达及其苏氨酸磷酸化也被部分阻断 ,以上结果提示ERK部分介导了LMP1诱导Ets

EB病毒相关性噬血细胞综合征患儿EB病毒潜伏膜蛋白1及Th1细胞因子的表达及其意义

目的:分析EB病毒相关性噬血细胞综合征(EB virus-associated hemophagocytic syndrome,EBVAHS)患儿EB病毒潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)、辅助性T细胞1(helper T cell1,Th1)细胞因子的表达水平及其与疗效的关系。方法:抽取郑州大学附属儿童医院儿科2014年2月至2018年1月收治的116例EB病毒感染患儿为研究对象,分为单核细胞增多症(infect iousmononucleosis,IM)组与EBV-AHS组,其中IM 66例,EBV-AHS 50例。EBV-AHS组按照国际组织细胞协会推荐的HLH-2004方案给予治疗,于治疗4周后评定近期疗效。另选取同期体检的健康儿童30例作为对照组。对照组于体检时、IM组于确诊时、EBV-AHS组于治疗前、治疗后采血,检测血清LMP1抗体表达及Th1细胞因子水平。结果:与对照组相比,IM组和EBV-AHS组患儿确诊时血清LMP1抗体、白介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ及肿瘤坏死因子(TNF)-α水平显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。IM组和EBV-AHS组患儿血清LMP1抗体,IL-2,IFN-γ,TNF-α水平差异亦有统计学意义(P<0.05)。治疗后EBV-AHS组50例患儿中,疾病缓解者17例(34.00%),有效者22例(44.00%),余下11例(22.00%)疾病活动。疾病缓解者、有效者血清LMP1抗体,IL-2,IFN-γ,TNF-α水平明显较治疗前降低(P<0.05),而疾病活动者血清LMP1抗体,IL-2,IFN-γ,TNF-α水平较治疗前无明显改善(P>0.05);且疾病缓解者、有效者、疾病活动者血清LMP1抗体,IL-2,IFN-γ,TNF-α水平均依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:EBV-AHS患儿血清LMP1抗体表达及Th1细胞因子水平较IM患儿及正常儿童显著升高,且其与疗效密切相关。

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌中结合磷酸化的TRAFs

对鼻咽癌中潜伏膜蛋白 1 (LMP1 )是否结合磷酸化的肿瘤坏死因子受体相关因子 (tumornecrosis factor receptor- associated factors,TRAFs)信号分子进行探讨 .首先应用 CSA/SP双染色法在 30例鼻咽癌活检组织中发现 1 6例 (52 % ) LMP1与 TRAF1、TRAF2和 TRAF3共表达于癌细胞胞膜及胞浆同一部位 .这提示 EB病毒 LMP1在鼻咽癌中可能结合 TRAF1、TRAF2或TRAF3发挥作用 .进一步以导入载体 p SG5的鼻咽癌细胞系 HNE2 - p SG5为对照 ,建立了稳定表达 LMP1的鼻咽癌细胞系 HNE2 - LMP1 ,利用这两种细胞系 ,以免疫共沉淀 - Western印迹方法 ,证实了 LMP1可与磷酸化的 TRAF1、TRAF2或 TRAF3直接或间接作用形成免疫共沉淀复合物 .

EB病毒潜伏膜蛋白LMP-1在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的观察EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)在鼻咽癌(NPC)鼻咽拭子中的表达,探讨LMP-1表达与NPC临床病理特征的关系。方法纳入2007年～2008年福建省肿瘤医院放疗科收治的经病理检查确诊为NPC且同意参加该试验的初治患者129例,均在治疗前应用鼻咽拭子法取鼻咽部黏膜脱落细胞,提取DNA,采用PCR法检测LMP-1基因的表达。结果 129例患者中有114例患者LMP-1呈阳性表达,另15例呈阴性表达,阳性率为88.37%(114/129);对照组中无1例呈阳性表达。LMP-1阳性表达率有颈部淋巴结转移组明显高于无颈部淋巴结转移组。LMP-1表达与患者年龄、性别、临床分期、T分期及M分期无相关性。结论 PCR法检测鼻咽拭子中LMP-1的检出率高于免疫组化法,LMP-1表达与鼻咽癌患者颈部淋巴结转移密切相关,临床中可预测鼻咽癌患者的转移潜能,LMP-1可能做为抗肿瘤转移靶向治疗的潜在靶点。

EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP的研究进展

EB病毒与鼻咽癌、Burkitt's淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、霍奇金病和某些因机体免疫力下降而产生的淋巴增生性疾病密切相关,其中EB病毒与鼻咽癌的关系尤为受到重视。EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)在细胞的恶性转化中起着相当重要的作用,又与鼻咽癌病人的治疗和预后有着密切的关系,本文就EB病毒潜伏膜蛋白1的研究近况与鼻咽癌治疗与预后判断进行综述。

JAK3蛋白在鼻咽癌细胞中参与STAT活化并受EB病毒潜伏膜蛋白1调控

为了探讨在鼻咽癌细胞 (NPC)中是否存在EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1) /JAK3/STAT信号传导途径 ,首先采用RT PCR方法对NPCJAK家族 4种成员检测 ,发现在两株鼻咽癌细胞株CNE1和HNE2中该家族 4种成员均有表达 .选择最有可能与LMP1相互作用的JAK家族成员JAK3作为我们的研究对象 .利用已建立的一株受四环素衍生物强力霉素 (doxycycline ,Dox)调控的LMP1表达的鼻咽癌细胞系 (Tet on LMP1HNE2 ) ,诱导Tet on LMP1HNE2细胞LMP1动态表达 ,蛋白质印迹发现JAK3的表达方式呈剂量和时间依赖性 .采用瞬间转染方法将STAT报告基因质粒 (GRR Luc)转染入pTet on LMP1HNE2细胞中 ,不同剂量的Dox促使LMP1的表达可以激活STAT报告基因活性 ,在 0 0 6mg/LDox诱导 36h时 ,STAT活性最高 .在该条件下 ,加入 3μmol/LJAK3特异性抑制剂WHI P131时 ,可抑制STAT的活性 .结果表明 :JAK3的表达在NPC细胞中受LMP1的调控 ,LMP1可以通过调控JAK3的表达参与STAT的活化 .

儿童狼疮性肾炎患者中EB病毒潜伏膜蛋白1的表达

目的通过实时定量逆转录PCR(RT-PCR)、肾脏免疫组化和ELISA 3种方法研究儿童狼疮性肾炎(LN)中EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)的表达,试图探讨LMP-1在儿童LN中的致病机制。方法 41例LN患儿和12例健康对照组,分别用RT-PCR法、免疫组化法、ELISA法检测两组外周血单核细胞(PBMCs)、肾脏组织及血清中LMP-1的表达。结果 1 RT-PCR法、免疫组化法、ELISA法检测LN患儿和健康对照者的阳性率分别为65.9%vs 8.3%,95.1%vs 16.7%,22.0%vs 8.3%,差异有统计学意义(P<0.05);2 3种方法检测LMP-1的表达,免疫组化法检测阳性率高于其他两种方法,差异有统计学意义(P<0.05)。结论儿童LN中存在EBV潜伏期基因LMP-1表达异常,其中肾脏组织中表达阳性率最高,提示LMP-1可能参与了儿童LN的发病。