EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2A对胃癌细胞增殖的影响

目的:构建EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的腺病毒表达载体,探讨LMP2A表达对胃癌细胞的作用.方法:RT-PCR扩增获取目的基因LMP2A,采用AdEasy系统构建携带目的基因的重组腺病毒载体pAd-2A,脂质体法将重组质粒pAd-2A转染HEK293细胞包装重组腺病毒.用重组腺病毒感染靶细胞SGC(胃癌细胞),通过MTT实验、流式细胞分析、激光共聚焦检测目的基因LMP2A表达对靶细胞增殖的影响.结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实,目的基因LMP2A正确插入重组质粒,HEK293细胞成功包装出具有稳定感染性的重组腺病毒,命名为vAd-2A,经测定病毒滴度为3.16×10^(12)pfu/L.MTT实验、流式细胞分析以及激光共聚焦检测结果显示,感染腺病毒vAd-2A的SGC细胞增殖旺盛(感染vAd-2A细胞vs感染vAd细胞和未感染病毒细胞,P<0.01),S期细胞比例升高(24 h:35.2%±5.1%vs 14.0%±3.4%,13.2%±4.6%,P<0.01;48 h:25.6%±4.1%vs 12.9%±2.6%,12.5%±3.2%,P<0.01),LMP2A可诱导细胞周期调节蛋白cyclinE的表达.结论:成功构建了EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的重组腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒,同时证实LMP2A可通过诱导cyclinE的表达促进SGC细胞增殖.

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的 :制备重组慢病毒载体p LMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖、迁移、侵袭的影响。方法 :利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切、测序验证,将重组慢病毒载体p LMP2A与包装质粒pdelta-8.91、p VSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR、免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验、Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响。结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体p LMP2A;RT-PCR、Western blot、免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力。结论:成功制备了慢病毒载体p LMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖、迁移、侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础。

鼻咽癌患者血清抗EB病毒潜伏膜蛋白2A抗体的检测及其临床意义

目的:检测鼻咽癌患者血清抗EB病毒潜伏膜蛋白2A抗体并探讨其临床意义。方法:以重组质粒p ET28a表达的EB病毒潜伏膜蛋白2A重组表位蛋白为检测抗原,ELISA和Western blot检测正常人和鼻咽癌患者血清抗EBV-LMP2A抗体。结果:ELISA检测鼻咽癌患者和正常人血清抗EBV-LMP2A抗体水平分别为0.966±0.127、0.425±0.103,两组比较差异具有统计学意义(P<0.01);Western blot检测二者的抗体水平比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:鼻咽癌患者血清EBV-LMP2A抗体表达显著高于正常对照,可能与鼻咽癌的发生有关,可作为鼻咽癌的辅助诊断指标。

EB病毒潜伏膜蛋白2重组腺病毒的构建及其免疫效果的研究

为了进一步研究以EB病毒潜伏膜蛋白2穴LMP2)为靶抗原制备EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗,利用AdEasy系统构建了EBV鄄LMP2的重组腺病毒。PCR鉴定结果证实病毒DNA中含有目的基因的特异性片段;RT鄄PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录;免疫酶和Westernblot的结果也显示LMP2蛋白在真核细胞得到表达。将扩增后的病毒感染Hela细胞测定病毒滴度为1.5×109pfu/ml。将重组病毒以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠,经免疫荧光检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现三种给药途径均可诱发小鼠针对LMP2的特异性体液免疫和细胞免疫,而用Ad5作为对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应。该研究将有益于进一步探索抗肿瘤特异性主动免疫作用在阻止肿瘤的生长、扩散或复发中的作用。对诱导机体产生特异性抗瘤活性有重要意义。

EB病毒潜伏膜蛋白2A在胃癌中的表达及与预后的关系

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)在胃癌组织中的表达及其与预后的关系。方法免疫组织化学染色检测100例胃癌及癌旁组织中LMP2A的表达情况,并分析LMP2A蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系;Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,分析76例随访患者LMP2A表达与患者总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)的关系。结果LMP2A在癌旁组织中几乎不表达,在胃癌组织中高表达,高表达率为47.0%(47/100);LMP2A高表达与胃癌的淋巴管浸润、血管浸润、临床分期有关(P<0.05);LMP2A高表达组的中位OS和PFS分别为52.0个月(95%CI:43.8~60.2个月)和47.0个月(95%CI:32.9~61.1个月),而LMP2A低表达组的中位OS和PFS均未达,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论LMP2A在胃癌组织中高表达,其可能在胃癌的发生和进展中起重要作用。

EB病毒潜伏膜蛋白2A抗原表位的融合表达及其意义

为了探讨含有EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)抗原表位片断表达的融合蛋白在鼻咽癌血清学检测中的应用意义,通过重叠延伸PCR方法,合成了3对相互重叠的寡核苷酸引物,涵盖LMP2A的主要的4个抗原表位,将它们拼接在一起构建一个多肽融合基因,克隆到PGEX-4T-2载体中表达融合蛋白,以GST亲和层析柱法纯化融合蛋白,鉴定后以此为抗原检测鼻咽癌患者的血清。结果表明,获得了含EB病毒LMP2A主要的4个抗原表位的融合蛋白(EC2A),蛋白纯度达90%以上,ELISA结果显示鼻咽癌患者血清的检出率为77.9%,正常人群血清为阴性,与常规的VCA-IgA法进行比较,有9份(13.3%)血清VCA-IgA为阴性而EC2A-IgG检出阳性,为鼻咽癌的临床检测提供了新思路,也为后续的单克隆抗体制备奠定了基础。

EB病毒编码的潜伏膜蛋白2A在鼻咽癌中的研究进展

鼻咽癌是我国南方和东南亚地区最常见的头颈部恶性肿瘤,其发病与EB病毒（EBV）感染关系密切。EBV属于人类γ疱疹病毒,广泛分布于全球,感染人群后,大多数成为无症状病毒携带者（即潜伏感染）。EBV主要编码潜伏膜蛋白1（LMP1）和LMP2、EB病毒核抗原1（EBNA1）和EB病毒编码的小RNA（EBERs）。

EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的:克隆EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)全长基因,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A,转染真核细胞后获得稳定表达LMP2A的细胞株。方法:采用RT-PCR技术从B95.8细胞中获得EB病毒LMP2A全长基因,克隆到测序载体pMD18-T中,经测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,与两辅助病毒载体PHIT456、PHIT60通过Lipofectamine2000共转染包装细胞293T,测定产生的重组逆转录病毒滴度并感染小鼠成纤维细胞L929,经Zeocine筛选后得到稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western blot法检测细胞中LMP2A mRNA和蛋白表达情况。结果:重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A经测序鉴定正确;转染后上清中病毒的滴度为5×108cfu/L,感染L929细胞后用Zeocine筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Westernblot检测结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达EBV-LMP2A。结论:表达EBV-LMP2A细胞株的构建为蛋白制备与纯化奠定了物质基础,也为后续的EBV相关性疾病疫苗的研究提供了新思路。

EB病毒潜伏膜蛋白2A胞外区重组基因在大肠杆菌中的表达及其在血清学检测中的应用

目的:构建EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)胞外区重组基因的表达载体在大肠杆菌中表达,并将表达的蛋白用于EB病毒相关鼻咽癌(NPC)患者的血清学检测。方法:用BamHⅠ和EcoRⅠ将含LMP2A胞外区重组基因的质粒pEC2A双酶切后,克隆到pET32a中。重组质粒经PCR、酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌(E.coli)BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测其抗原活性。用纯化的蛋白进行鼻咽癌患者血清学检测。结果:重组表达质粒经PCR及酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确。SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子质量约为40ku。以此为抗原能在鼻咽癌患者血清中检测到特异性的抗体。结论:成功获得了LMP2A胞外区重组基因表达的蛋白,纯化的蛋白可用于EBV相关鼻咽癌患者的血清学检测。

EB病毒潜伏膜蛋白2的抗原表位预测及其与HLA等位基因的相关性分析

目的分析EB病毒潜伏膜蛋白2(LMP2)的抗原表位;预测与EBV相关的HLA等位基因并进行分析。方法利用多种生物信息软件分析LMP2的同源性、B细胞抗原表位、T细胞相关表位以及与LMP2蛋白具有高结合力的HLA等位基因;研究该等位基因在中国各地的基因频率,从而推断EB的易感人群。结果EB病毒LMP2蛋白氨基酸序列比较保守,同源性在96.1%~100%之间;可能存在9个B细胞抗原表位,2个CTL细胞表位和2个Th细胞表位;HLA等位基因HLA-A*0201与LMP2结合力较强,在山西、北京、石家庄、天津、江苏、广州地区人群中的基因频率较高。结论预测了EB病毒LMP2蛋白的抗原表位,为EB病毒的疫苗研究和免疫诊断试剂的研制打下基础。HLA-A*0201与EB病毒相关性较高;EB病毒可能在山西、北京、石家庄、天津、江苏、广州地区更易发生传播。

EB病毒潜伏膜蛋白2A_(1-119)重组质粒的表达及鉴定

目的:构建含EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白(LMP)2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果:pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论:EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。

痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的:探讨痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)潜伏期膜蛋白2A(LMP2A)基因转染树突状细胞(DC)对DC的表型和功能的影响,以及EBV相关肿瘤免疫治疗性疫苗的可行性。方法:用EBV-LMP2A基因重组痘苗病毒(Vac-LMP2A)转染成熟的DC,流式细胞术(FACS)检测转染前后DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80、HLA-DR变化;3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖等功能的改变。结果:转染后LMP2A蛋白在DC细胞内高表达。Vac-LMP2A转染成熟DC前后对其表面共刺激分子及特征性表面标志无影响,转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结论:痘苗病毒载体是介导外源基因LMP2A转染DC的有效载体,Vac-LMP2A转染成熟DC对DC表型和功能无明显影响,是EBV相关肿瘤如鼻咽癌免疫治疗的理想载体。

EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP的研究进展

EB病毒与鼻咽癌、Burkitt's淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、霍奇金病和某些因机体免疫力下降而产生的淋巴增生性疾病密切相关,其中EB病毒与鼻咽癌的关系尤为受到重视。EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)在细胞的恶性转化中起着相当重要的作用,又与鼻咽癌病人的治疗和预后有着密切的关系,本文就EB病毒潜伏膜蛋白1的研究近况与鼻咽癌治疗与预后判断进行综述。

含EB病毒LMP2A毕氏酵母表达载体的构建与表达LMP2A蛋白的检测

目的:构建EB病毒潜伏膜蛋白2A的表达载体,并在真核生物毕氏酵母细胞中表达。方法:用EcoR I和Not I将含LMP2A全长编码基因的质粒PCIcc双酶切后,克隆到毕氏酵母载体PICZαA中,构建重组表达质粒pPICZαA-LMP2A。pICZαA-LMP2A经Sac I酶切线性化,采用氯化锂的方法转化毕氏酵母GS115,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得LMP2A阳性克隆的菌株,用PCR鉴定阳性酵母转化子,并分别将阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE电泳和western-blotting分析。结果:重组质粒pPICZαA-LMP2A经PCR和酶切鉴定为阳性。SDS-PAGE电泳和western-blotting结果显示表达蛋白的相对分子量为54 Kda,与预计值相同。结论:构建了LMP2A毕氏酵母表达载体,并在酵母细胞中成功表达。

鼻咽癌组织中EBV潜伏膜蛋白2跨膜区CTL表位序列分析

背景与目的:Epstein-Barr病毒在华南地区鼻咽癌细胞中表达核抗原1(EBNA1)、潜伏膜蛋白1(LMP1)和潜伏膜蛋白2(LMP2)等病毒蛋白质。LMP2mRNA不仅几乎100%表达于鼻咽肿瘤细胞,而且LMP2蛋白还具有较强的免疫原性,是一个较理想的免疫治疗靶点。本研究分析广州地区来源鼻咽癌组织的LMP2基因跨膜区的CTL表位序列,为设计以LMP2抗原为靶点的鼻咽癌免疫治疗提供依据。方法:收集广州地区鼻咽癌患者鼻咽活检组织20例和正常鼻咽粘膜活检组织3例,提取DNA,半巢式PCR扩增LMP2基因跨膜区,直接测序,分析CTL表位序列。结果:与标准株B95.8相比,鼻咽癌和正常鼻咽粘膜活检组织来源的LMP2基因跨膜区存在14处碱基替换,形成6处氨基酸替换,导致4处CTL表位序列变异(SSC、TYG、CLG和VMS),其中VMS多态性为初次报道。由于从鼻咽癌组织扩增的LMP2序列与从正常鼻咽粘膜扩增的LMP2序列相同,表明这些变化是地域相关的病毒多态性而非鼻咽癌相关的病毒变异。结论:广州地区来源的Epstein-Barr病毒LMP2基因存在多态性,产生4处CTL表位序列变化。在设计以LMP2为靶点的免疫治疗时,应充分考虑病毒基因多态性的影响。

埃泼斯坦-巴尔病毒潜伏膜蛋白2A特异性细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导研究

目的:利用含埃泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒(rVV-LMP2A)感染的人树突状细胞(DC)体外诱导EBV-LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法:rVV-LMP2A感染的DC分别在培养第1、8天刺激相同MHC背景的人外周血单个核细胞(PBMC),在IL-2作用下体外诱导EBV特异性CTL。培养第15天乳酸脱氢酶法检测CTL的特异性杀伤活性。结果:诱导的CTL对rVV-LMP2A感染的靶细胞在效靶比为5:1、10:1和15:1时,特异性杀伤率分别为63.5％、65.5％和67.9％。结论:rVV-LMP2A感染的DC刺激相同MHC背景的PBMC可诱导出较高杀伤活性的EBV特异性CTL。

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性。方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化。制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性。结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析。结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础。

EB病毒潜伏膜蛋白LMP1、VEGF和cyclinD1在乳腺癌中的表达及其相关性

目的:探讨乳腺癌中EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和细胞周期蛋白D1(cyclinD 1)的表达及其相关性。方法:收集乳腺癌标本构建组织芯片,应用免疫组化方法检测LMP1、VEGF和cyclinD 1的表达,并结合临床病理因素进行相关分析。结果:乳腺癌组织中LMP1、VEGF及cyclinD 1的表达率分别为17.8%(19/107)、85.0%(91/107)和64.5%(69/107);LMP1和cyclinD 1的表达与患者年龄、肿瘤大小、病理学类型、淋巴结转移及脉管侵犯均无明显相关性(P>0.05),而两者的表达均与组织学分级有关(P<0.05);VEGF的表达与患者年龄、肿瘤大小、病理学类型、组织学类型及脉管侵犯均无明显相关(P>0.05),而与淋巴结转移存在相关性(P<0.05);LMP1的表达与VEGF和cyclinD 1均明显相关(P<0.05),同时,VEGF与cyclinD 1表达明显相关(P<0.05)。结论:乳腺癌中LMP1可能直接上调VEGF的表达,或者LMP1通过促进cyclinD 1的表达来上调VEGF的表达,从而对乳腺癌的淋巴转移及发生发展起到促进作用。

过表达EB病毒潜伏期膜蛋白1(LMP1)的人B淋巴细胞株的建立

目的构建EB病毒潜伏期膜蛋白1(LMP1)基因的真核表达载体,通过电穿孔法转染人B淋巴瘤细胞株Ramos细胞,建立稳定的LMP1表达细胞株。方法扩增带有EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点的LMP1编码基因,克隆至pcDNA3.1-EF1a-mcs-3FLAG-CMV-EGFP真核表达载体,挑取阳性单克隆感受态细胞行PCR以及测序后将重组质粒通过电穿孔法转染Ramos细胞, G418筛选稳定表达LMP1的细胞株, PCR和Western blot法分别检测LMP1 mRNA和蛋白在Ramos细胞中的表达。结果 PCR与测序证实成功构建了LMP1重组质粒,建立了稳定转染的Ramos细胞,且LMP1蛋白可在细胞中成功表达。结论成功建立了稳定表达LMP1的Ramos细胞。