鼻咽癌患者血清抗EB病毒潜伏膜蛋白2A抗体的检测及其临床意义

目的:检测鼻咽癌患者血清抗EB病毒潜伏膜蛋白2A抗体并探讨其临床意义。方法:以重组质粒p ET28a表达的EB病毒潜伏膜蛋白2A重组表位蛋白为检测抗原,ELISA和Western blot检测正常人和鼻咽癌患者血清抗EBV-LMP2A抗体。结果:ELISA检测鼻咽癌患者和正常人血清抗EBV-LMP2A抗体水平分别为0.966±0.127、0.425±0.103,两组比较差异具有统计学意义(P<0.01);Western blot检测二者的抗体水平比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:鼻咽癌患者血清EBV-LMP2A抗体表达显著高于正常对照,可能与鼻咽癌的发生有关,可作为鼻咽癌的辅助诊断指标。

EB病毒潜伏膜蛋白2A在胃癌中的表达及与预后的关系

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)在胃癌组织中的表达及其与预后的关系。方法免疫组织化学染色检测100例胃癌及癌旁组织中LMP2A的表达情况,并分析LMP2A蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系;Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,分析76例随访患者LMP2A表达与患者总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)的关系。结果LMP2A在癌旁组织中几乎不表达,在胃癌组织中高表达,高表达率为47.0%(47/100);LMP2A高表达与胃癌的淋巴管浸润、血管浸润、临床分期有关(P<0.05);LMP2A高表达组的中位OS和PFS分别为52.0个月(95%CI:43.8~60.2个月)和47.0个月(95%CI:32.9~61.1个月),而LMP2A低表达组的中位OS和PFS均未达,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论LMP2A在胃癌组织中高表达,其可能在胃癌的发生和进展中起重要作用。

EB病毒潜伏膜蛋白2A_(1-119)重组质粒的表达及鉴定

目的:构建含EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白(LMP)2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果:pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论:EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。

EB病毒潜伏膜蛋白2重组腺病毒的构建及其免疫效果的研究

为了进一步研究以EB病毒潜伏膜蛋白2穴LMP2)为靶抗原制备EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗,利用AdEasy系统构建了EBV鄄LMP2的重组腺病毒。PCR鉴定结果证实病毒DNA中含有目的基因的特异性片段;RT鄄PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录;免疫酶和Westernblot的结果也显示LMP2蛋白在真核细胞得到表达。将扩增后的病毒感染Hela细胞测定病毒滴度为1.5×109pfu/ml。将重组病毒以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠,经免疫荧光检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现三种给药途径均可诱发小鼠针对LMP2的特异性体液免疫和细胞免疫,而用Ad5作为对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应。该研究将有益于进一步探索抗肿瘤特异性主动免疫作用在阻止肿瘤的生长、扩散或复发中的作用。对诱导机体产生特异性抗瘤活性有重要意义。

EB病毒编码的潜伏膜蛋白2A在鼻咽癌中的研究进展

鼻咽癌是我国南方和东南亚地区最常见的头颈部恶性肿瘤,其发病与EB病毒（EBV）感染关系密切。EBV属于人类γ疱疹病毒,广泛分布于全球,感染人群后,大多数成为无症状病毒携带者（即潜伏感染）。EBV主要编码潜伏膜蛋白1（LMP1）和LMP2、EB病毒核抗原1（EBNA1）和EB病毒编码的小RNA（EBERs）。

鼻咽癌组织中bcl-2及EB病毒潜伏膜蛋白表达与放射诱发细胞凋亡的关系

目的 探讨鼻咽癌 (NPC)组织bcl 2及EB病毒潜伏膜蛋白 (LMP)表达与放射诱发细胞凋亡的关系。方法 采用免疫组化S P法及TdT酶介导的生物素化dUTP缺口末端标记技术 (TUNEL法 ) ,分别检测 35例NPC组织中bcl 2及EB病毒LMP的表达 ,以及放疗总量为 10Gy时NPC组织的细胞凋亡率 (AR )。结果 NPC组织bcl 2及LMP的表达率分别为 71.4%(2 5 /35 )、45 .7% (16 /35 ) ,AR为 (6 1.3± 11.8) %。放疗后的AR与LMP表达呈正相关 ,与bcl 2的表达呈负相关。结论 LMP有促进NPC放疗后细胞凋亡的生物学作用 ,其作用与bcl 2的表达无关 ;而bcl 2表达阴性者对放射线的敏感较阳性者强。

EB病毒潜伏膜蛋白2的抗原表位预测及其与HLA等位基因的相关性分析

目的分析EB病毒潜伏膜蛋白2(LMP2)的抗原表位;预测与EBV相关的HLA等位基因并进行分析。方法利用多种生物信息软件分析LMP2的同源性、B细胞抗原表位、T细胞相关表位以及与LMP2蛋白具有高结合力的HLA等位基因;研究该等位基因在中国各地的基因频率,从而推断EB的易感人群。结果EB病毒LMP2蛋白氨基酸序列比较保守,同源性在96.1%~100%之间;可能存在9个B细胞抗原表位,2个CTL细胞表位和2个Th细胞表位;HLA等位基因HLA-A*0201与LMP2结合力较强,在山西、北京、石家庄、天津、江苏、广州地区人群中的基因频率较高。结论预测了EB病毒LMP2蛋白的抗原表位,为EB病毒的疫苗研究和免疫诊断试剂的研制打下基础。HLA-A*0201与EB病毒相关性较高;EB病毒可能在山西、北京、石家庄、天津、江苏、广州地区更易发生传播。

埃泼斯坦-巴尔病毒潜伏膜蛋白2A特异性细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导研究

目的:利用含埃泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒(rVV-LMP2A)感染的人树突状细胞(DC)体外诱导EBV-LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法:rVV-LMP2A感染的DC分别在培养第1、8天刺激相同MHC背景的人外周血单个核细胞(PBMC),在IL-2作用下体外诱导EBV特异性CTL。培养第15天乳酸脱氢酶法检测CTL的特异性杀伤活性。结果:诱导的CTL对rVV-LMP2A感染的靶细胞在效靶比为5:1、10:1和15:1时,特异性杀伤率分别为63.5％、65.5％和67.9％。结论:rVV-LMP2A感染的DC刺激相同MHC背景的PBMC可诱导出较高杀伤活性的EBV特异性CTL。

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的 :制备重组慢病毒载体p LMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖、迁移、侵袭的影响。方法 :利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切、测序验证,将重组慢病毒载体p LMP2A与包装质粒pdelta-8.91、p VSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR、免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验、Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响。结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体p LMP2A;RT-PCR、Western blot、免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力。结论:成功制备了慢病毒载体p LMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖、迁移、侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础。

鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1活化cyclinD1的表达

为了探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(EBV LMP1)促进细胞增殖 ,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制 ,研究了LMP1在鼻咽癌细胞中调节cyclinD1表达 ,进而影响细胞周期行进及细胞恶性表型改变 ,并初步确定了LMP1发挥该功能的结构域 .利用已建株的Tet on LMP1 HNE2鼻咽癌细胞系 ,蛋白质印迹实验分析LMP1诱导cyclinD1蛋白质表达的表达动力学 ,包括时间效应及剂量效应 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,确定LMP1活化cyclinD1表达的结构域 .同时结合基因诱导表达及反义寡聚核酸技术阻断基因表达的实验方法 ,进一步确定LMP1上调的cyclinD1功能 ,即对细胞周期行进及细胞恶性表型的影响 .结果表明LMP1确实可以诱导cyclinD1的表达 (2～ 4倍 ) ,且诱导具有时间依赖性及剂量依赖性 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,结合报道基因分析法 ,确定与空白载体细胞系比较 ,野生型LMP1从转录水平可反式激活cyclinD1报道基因活性约 11 2倍 ,其中CTAR1及CTAR2均可活化cyclinD1表达 ,但以CTAR2为主 ,与野生型LMP1诱导cyclinD1反式激活活性比较 ,CTAR1缺失导致cyclinD1报道基因活性下降 2 3 6 % ,CTAR2缺失导致cyclinD1活性下降约 80 7% ,C端均缺失时cyclinD1活性只?

EB病毒潜伏膜蛋白1通过TRAF/TRADD激活JNK信号途径

为了探讨在鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)激活c Jun氨基端激酶 (JNK)信号途径的分子机制 ,利用可调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系L7,蛋白质印迹检测 ,发现LMP1能够促进JNK的活化 ;利用稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2 LMP1及其三种突变体HNE2 LMP1ΔCTAR 1、HNE2 LMP1ΔCTAR2、HNE2 LMP1ΔCTAR 1,2及LMP1阴性的HNE2 为材料 ,采用蛋白质印迹和报告基因法分析JNK和活化蛋白 1(AP1)活化情况 ,结果显示HNE2 LMP1和HNE2 LMP1ΔCTAR1中磷酸化JNK蛋白表达量和AP1活性都无显著差异 ,而与HNE2 LMP1ΔCTAR2、HNE2 LMP1ΔCTAR1,2、阴性对照HNE2及空白载体转染细胞的JNK蛋白表达和AP1活性具有显著差异 ;进一步比较转染TRAF、TRADD显性负性突变体鼻咽癌细胞系HNE2 LMP1中磷酸化的JNK量和AP1活性 ,结果显示 :TRAF DN和TRADD DN的导入使活化的JNK蛋白和AP 1活性显著降低 ,二者间无显著差异 ,提示TRAF和TRADD可能参与了LMP1对JNK和AP 1的活化 .以上结果提示在鼻咽癌细胞系中LMP1功能结构域CTAR2通过结合TRAF/TRADD激活JNK从而活化重要的转录因子AP1.

EB病毒编码的潜伏膜蛋白1参与鼻咽癌恶性演进的转录调控实验研究

探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)激活激活蛋白 1(AP1) ,和核转录因子 (NF κB)在鼻咽癌细胞SUNE 1及亚细胞株恶性演进中的作用 .运用报告基因法和凝胶电泳迁移率法 (EMSA)分析AP1和NF κB反式激活活性和DNA结合活性 ,蛋白质印迹检测蛋白质表达 ;裸鼠致瘤实验结合组织制片研究瘤细胞的成瘤和转移能力 .结果显示恶性程度不同的SUNE 1亚细胞株的反式激活活性、DNA结合活性、LMP1蛋白表达及c Jun氨基端激酶 (JNK)活性均存在明显差异 ,且与细胞恶性程度正相关 .这些结果提示LMP1活化AP1和NF κB的信号通路参与了鼻咽癌细胞SUNE 1的恶性演进过程 .

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌细胞中通过STAT3促进VEGF表达

探讨了EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)是否通过STAT3调控诱导血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的表达 .利用蛋白质印迹的方法对HNE2、HNE2 LMP1以及瞬时转染STAT3显性负性突变体STAT3β的HNE2 LMP1细胞中VEGF含量进行检测 ,发现LMP1可以上调VEGF的表达 ,而STAT3β可以抑制VEGF的上调 ;利用LMP1可控表达细胞系tet on LMP1 HNE2进行LMP1时间和剂量诱导表达研究 ,发现VEGF可以随LMP1的动态表达而表达 ;将VEGF野生型报告基因和VEGF潜在的STAT3转录因子突变体报告基因与LMP1表达载体分别共转染研究发现 ,LMP1可以激活VEGF的转录 ,这种转录通过VEGF启动子区STAT3转录因子的结合位点发挥作用 ;电泳迁移率变动分析 (EMSA)确证了STAT3的这种DNA位点的特异性活性 .结果表明 :EB病毒编码的LMP1在鼻咽癌细胞中可以增加VEGF的转录和表达 。

EB病毒潜伏膜蛋白1通过Survivin介导细胞增殖和抑制细胞凋亡

利用间接免疫荧光、基因转染、抗体剔除 (Ab knock out)、细胞平板集落形成、流式细胞术以及半胱氨酸天冬酰胺酶 (caspase3)活性检测等方法 ,从survivin核移位、Rb磷酸化、细胞周期演进、细胞克隆形成和细胞凋亡等方面 ,探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)调控细胞增殖和细胞凋亡双重效应的分子机制 .结果发现 ,LMP1表达介导survivin核移位 ,促进细胞Rb磷酸化增加 ,S期细胞数显著增加 ;LMP1通过survivin促进细胞克隆形成 .用Ab knock out阻断survivin核移位和survivin反义核酸抑制survivin表达时 ,Rb磷酸化水平降低 ,S期细胞减少 ,抑制LMP1介导的细胞增殖 ,活化细胞caspase 3,诱导细胞凋亡 .结果提示 。

EB病毒潜伏膜蛋白1多态性与鼻咽癌的关系

为了分析广东地区鼻咽癌病人和非鼻咽癌病人携带的Epstein Barr病毒 (EBV)潜伏膜蛋白 1(LMP1)基因多态性 ,探讨LMP1基因羧基端缺失 30个碱基的EBV是否与华南地区鼻咽癌高发有关。为此收集了初治的 10 7例鼻咽癌病人和 10 6例非鼻咽癌肿瘤病人的漱口液 ,用巢式PCR扩增LMP1羧基端 ,观察缺失型LMP1的构成比。同时 ,测序分析缺失型LMP1编码区序列 ,了解缺失型LMP1多态性与鼻咽癌的关联度。结果 :在 5 0 %的样品中可检出LMP1基因 ,缺失型LMP1在鼻咽癌病人和非鼻咽病人的构成比相似 ,约占 70 % ,原型和缺失型LMP1混合感染少见 (0～ 6 % )。另外 ,广州地区的缺失型LMP1序列与上海、台湾、香港地区的缺失型LMP1基因高度同源 ,鼻咽癌病人是和非鼻咽癌病人携带的缺失型LMP1基因序列基本相同。此结果表明 ,广州地区流行的LMP1基因羧基端缺失 30个碱基的EBV株 ,漱口液中检测出的缺失型与原型LMP1构成比约为 7:3,在鼻咽癌病人和非鼻咽癌病人此分布情况相似。

EB病毒潜伏膜蛋白1调控细胞凋亡的cDNA阵列分析

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 (LMP1)介导细胞凋亡和抑制细胞凋亡双重效应的机制 ,采用已建立的受四环素调控的LMP1表达的鼻咽癌细胞系 (pTet on LMP1HNE2 ) ,定量诱导 pTet on LMP1HNE2细胞LMP1动态表达 ,分别与含有细胞凋亡相关基因为主的AtlasapoptosiscDNAexpressionarray膜杂交 ,分析LMP1介导的表达差异基因。结果表明 :①LMP1介导细胞凋亡和抑制细胞凋亡的基因的表达 ,同时上调或下调某些与细胞凋亡相关基因的表达 ;②LMP1不仅介导细胞凋亡和抑制凋亡基因的表达 ,同时介导细胞分裂分化和增殖基因的表达 ,LMP1同时介导功能不同甚至功能相反的基因表达 ;③LMP1介导的基因表达与其表达持续时间和表达水平相关 ,不同表达水平和不同表达时间介导的基因表达谱不同。因此 ,LMP1具有介导细胞凋亡和抑制凋亡基因表达的双重生物学效应 ,同时介导细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等多种生物学效应基因的表达 ,从而参与细胞的癌变。

重组腺相关病毒介导RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞影响的动物试验

目的探讨EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP-1)对于鼻咽癌细胞在体内增殖及转移能力的影响。方法设计针对EBV-LMP-1的特异性发夹状RNA(shRNA)干扰序列,构建2种重组腺相关病毒(rAAV)载体:(增强型绿色荧光蛋白,EGFP)rAAV-EGFP和rAAV-shRNA-LMP-1,以不同滴度rAAV-EGFP转染鼻咽癌C666-1细胞确定最佳转染复数(MOI),rAAV-shRNA-LMP-1按MOI转染C666-1,RT-PCR鉴定抑制效率,将体外转染RNA干扰后的C666-1细胞注入裸鼠肝脏包膜下制作鼻咽癌异位肝种植的肝肺转移模型,观察肝脏成瘤及肝内、肺转移情况,分析LMP-1基因沉默在动物水平对鼻咽癌细胞成瘤及转移能力的影响。结果rAAV-EGFP以5×104v.g(virus genome,病毒基因组数)/细胞转染C666-1细胞,转染效率大于95%,RT-PCR鉴定rAAV-shRNA-LMP-1以5×104v.g/细胞转染C666-1后目的基因抑制效率大于90%,动物试验结果显示rAAV-shRNA-LMP-1组肝脏成瘤体积与对照组rAAV-EGFP无显著差异,但显著减少了种植肿瘤的肝内及肺转移率。结论通过rAAV介导RNA干扰能有效抑制LMP-1基因表达,可在动物水平抑制鼻咽癌细胞转移,但对鼻咽癌细胞生长无显著影响。

携带EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因小鼠的制备

ＥＢ病毒潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）具有致癌活性，构建含金属硫蛋白基因－１（ＭＴ－１）调控区和ＬＭＰ基因的ｐＢＲ３２２－ＭＴ－ＬＭＰ质粒，用显微注射法将ＭＴ－ＬＭＰ转基因接种于小鼠受精卵内制备转基因小鼠的动物模型。结果：ａ．注射后卵的存活率和仔鼠出生率分别为７３％和１３％；ｂ．转基因鼠尾部组织ＤＮＡ分析，ＰＣＲ法证明二只小鼠有ＬＭＰ基因扩增带，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交亦显示ＰＣＲ阳性鼠有特异的ＬＭＰ杂交信号，这说明ＬＭＰ基因已整合于鼠基因组，整合率为８％。结果说明，构建携带ＬＭＰ基因的转基因动物模型已成功。

EB病毒潜伏膜蛋白1通过结合TRAFs调控NF-κB

为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)的致瘤机制 ,对鼻咽癌中LMP1激活重要的核转录因子NF κB机制进行了研究 .首先 ,采用免疫共沉淀 蛋白质印迹在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2 LMP1中证实LMP1与TRAF1,2 ,3结合形成免疫共沉淀复合物 ,进一步以野生型LMP1及其三种突变体的鼻咽癌细胞系LMP1(野生型 ,wt)、HNE2 LMP1del187～ 35 1(CTAR1缺失型 )、HNE2 LMP1(1～ 2 31) (CTAR2缺失型 )、HNE2 LMP1(1～ 187) (羧基端胞浆区缺失型 )、HNE2 pSG5 (空白载体型 )为材料 ,结合NF κB报道基因质粒(pGL2 NF κB luc)的荧光素酶活性表达分析NF κB的活性 ,证实 :较之母细胞 ,野生型LMP1活化NF κB达13 8倍 ,LMP1(1～ 187)几乎不活化NF κB ,LMP1(1～ 2 31)活化NF κB达 4 9倍 ,LMP1(del187～ 35 1)活化NF κB达 9 1倍 ;TRAF1过表达升高LMP1(wt)及LMP1(1～ 2 31)介导的NF κB活性 ,而对LMP1(del187～ 35 1)活化NF κB无影响 ;TRAF3过表达或TRAF3负显性突变体抑制LMP1(wt)及LMP1(1～ 2 31)介导的NF κB活性 ,而不影响LMP1(del 187～ 35 1)活化NF κB ;TRAF2过表达升高LMP1(wt)、LMP1(1～2 31)及LMP1(del 187～ 35 1)介导的NF κB活性 .这些结果表明 :鼻咽癌中LMP1通过TRAF1、TRAF2或TRAF3调控NF κB 。

痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的:探讨痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)潜伏期膜蛋白2A(LMP2A)基因转染树突状细胞(DC)对DC的表型和功能的影响,以及EBV相关肿瘤免疫治疗性疫苗的可行性。方法:用EBV-LMP2A基因重组痘苗病毒(Vac-LMP2A)转染成熟的DC,流式细胞术(FACS)检测转染前后DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80、HLA-DR变化;3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖等功能的改变。结果:转染后LMP2A蛋白在DC细胞内高表达。Vac-LMP2A转染成熟DC前后对其表面共刺激分子及特征性表面标志无影响,转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结论:痘苗病毒载体是介导外源基因LMP2A转染DC的有效载体,Vac-LMP2A转染成熟DC对DC表型和功能无明显影响,是EBV相关肿瘤如鼻咽癌免疫治疗的理想载体。