EB病毒编码的小mRNA阴性结外NK/T细胞淋巴瘤的临床特征及预后分析

背景与目的:结外NK/T细胞淋巴瘤(extranodal natural killer/T-cell lymphoma,ENKTL)为非霍奇金淋巴瘤的一个亚型,中国发病率远高于西方国家。该病恶性程度高,对化疗不敏感,生存期短,预后差,EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染与该病的发生、发展有密切关系,但仍有少数患者无EBV感染。本研究探讨EBV编码的小m RNA(EBV-encoded small RNA,EBER)原位杂交阴性患者的临床特征及预后相关因素。方法:选取2011年8月—2015年10月郑州大学第一附属医院病理科诊断为ENKTL的326例标本,采用原位杂交技术检测其EBER表达,回顾性分析8例EBER阴性患者临床特征及预后相关因素。结果:326例ENKTL中,EBER表达阴性率为2.45%(8/326),8例EBER表达阴性患者的中位生存期为17个月。EBER阴性与EBER阳性患者的生存率log-rank检验,两条生存曲线差异有统计学意义(χ2=6.407,P=0.011)。多变量Cox比例风险回归分析表明,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)与EBER阴性ENKTL患者预后有关(P=0.008),血浆中EBV-DNA拷贝数与EBER阴性患者的预后无关(P>0.05)。结论:EBER表达阴性ENKTL发病率低,预后较EBER阳性患者差,LDH升高可能是其预后不良因素。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的长链非编码RNA和mRNA转录组分析

为了挖掘猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞后宿主细胞长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA表达谱的变化,对PRRSV感染Marc-145细胞的lncRNA和mRNA进行转录组测序和分析。生物信息学分析结果显示,PRRSV感染后Marc-145细胞有39个差异表达lncRNA(DElncRNA)和1320个差异表达mRNA(DEG)。进一步的富集分析结果显示,这些DElncRNA和DEG主要富集在氧化磷酸化信号通路。DElncRNA和DEG的联合分析结果显示,与lncRNA共表达的mRNA主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、神经营养素信号通路、AMPK信号通路、HIF-1信号通路、内质网中的蛋白质加工和碳代谢相关的信号通路,这些通路主要与宿主免疫有关。综上,PRRSV感染导致Marc-145细胞的lncRNA和mRNA表达谱均发生了改变,经生物信息学分析,推测差异表达产物可能在宿主对PRRSV感染的先天免疫反应中发挥重要作用。

EB病毒编码的潜伏膜蛋白1参与鼻咽癌恶性演进的转录调控实验研究

探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)激活激活蛋白 1(AP1) ,和核转录因子 (NF κB)在鼻咽癌细胞SUNE 1及亚细胞株恶性演进中的作用 .运用报告基因法和凝胶电泳迁移率法 (EMSA)分析AP1和NF κB反式激活活性和DNA结合活性 ,蛋白质印迹检测蛋白质表达 ;裸鼠致瘤实验结合组织制片研究瘤细胞的成瘤和转移能力 .结果显示恶性程度不同的SUNE 1亚细胞株的反式激活活性、DNA结合活性、LMP1蛋白表达及c Jun氨基端激酶 (JNK)活性均存在明显差异 ,且与细胞恶性程度正相关 .这些结果提示LMP1活化AP1和NF κB的信号通路参与了鼻咽癌细胞SUNE 1的恶性演进过程 .

EB病毒编码LMP-1在鼻咽癌中的致瘤机制

EB病毒的基因产物中LMP-1是最主要的转化蛋白,其致瘤作用日益受到人们的重视。本文论述了EB病毒编码的LMP-1的结构、致瘤机制,以及临床上检测LMP-1对鼻咽癌诊断的意义。

EB病毒编码的小RNA荧光双重标记技术的建立

目的利用原位杂交联合免疫荧光建立EB病毒编码的小RNA(EBER)的荧光双重标记方法。方法收集2018年12月至2019年11月于首都医科大学附属北京友谊医院病理科诊断为淋巴瘤患者的蜡块20例,其EBER原位杂交检测结果均为阳性。每例取蜡块进行连续切片,每例切片2张,其中1张切片进行荧光双重标记,另1张作为阴性对照。通过荧光显微镜查看双重荧光标记的效果。结果荧光双重标记成功后细胞和组织结构完整。原位杂交联合免疫荧光阳性的细胞核呈绿色荧光,免疫荧光阳性的细胞膜呈红色荧光,双重标记阳性细胞的膜与核红绿荧光对比鲜明。结论建立了一种新的EBER荧光双重标记方法,且此方法可以用于判断EB病毒感染的细胞属于B细胞还是T细胞,有助于淋巴瘤的诊断。

EB病毒编码的microRNAs参与肿瘤的发生和发展

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种明确的致瘤性病毒,与鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤等多种肿瘤的发生和发展密切相关。EBV共编码44种成熟的微RNA(microRNAs,miRNAs),可调节病毒自身和宿主基因的表达。EBV编码的miRNAs(Epstein-Barr virus-encoded microRNAs,EBV miRNAs)及其所调控的靶分子参与肿瘤细胞的凋亡、增殖、侵袭和转移等方面的生物学功能,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。

EB病毒相关胃癌迁移、侵袭相关miRNA和lncRNA研究进展

胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤,死亡率居肿瘤相关死亡的第3位。EB病毒(EBV)感染在人群中非常普遍,与各种人类肿瘤有关,如鼻咽癌、胃癌和淋巴瘤,其中EB病毒相关胃癌(EBVaGC)约占所有胃癌的1.3%~30.9%。在EBV相关肿瘤中,许多非编码RNA(ncRNA)参与了肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等过程的调控,ncRNA与潜在靶基因的相互作用逐渐成为研究热点。文章综述了与胃癌迁移、侵袭相关的ncRNA的研究进展,以期为后续胃癌的研究提供参考。

生物素标记寡核苷酸探针改良原位杂交法检测石蜡包埋组织中EB病毒mRNA

采用生物素标记的寡核苷酸探针，应用改良的原位杂交方法，检测了鼻咽癌及淋疤结转移癌标本石蜡包埋组织中的ＥＢ病毒ｍＲＮＡ。结果显示，ＥＢ病毒阳性反应清晰，无非特异性背景。结果表明，本实验中所应用的探针及改良的原位杂交方法可以迅速准确地检测组织内ＥＢ病毒ｍＲＮＡ的存在。

136例中国北方汉族人群经典型霍奇金淋巴瘤与EB病毒感染的相关性研究

目的：EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染与多种肿瘤的发生关系密切，现已证实EBV感染与经典型霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin lymphoma，CHL）发生关系尤为密切，但CHL患者中EBV检出率因种族、地域、性别和年龄的不同而有所差异，本研究目的在于探讨中国北方地区CHL发病与EBV感染的相关性。方法：用原位杂交的方法检测136例确诊为CHL病例中EBV编码的小RNA（Epstein-Barr virus encoded RNA，EBER）。结果：在136例CHL患者中EBER的总阳性率为28%（37/136），其中混合细胞型（mixed cellularity，MC）阳性率最高为49%（23/47）（P〈0.001），其次为富于淋巴细胞型（1ymphocyte rich，LR）30%（3/10），结节硬化型（nodular sclerosis，NS）14%（10/73），淋巴细胞消减型（1ymphocyte depletion，LD）0例（0/2）。CHL发病年龄呈单峰分布，主要在21～30岁年龄组。NS型在21～30年龄组出现一个明显单峰，而MC型在41～50岁年龄组存在一个略低的峰，EBER阳性率在0～10岁和41～50岁这两个年龄组分别有两个峰值（21.6%和24.3%）。结论：中国北方汉族人群CHL的发病与EBV的感染有一定的关系，其中以MC与EBV的关系较为密切。

Th17、Treg细胞在小儿EB病毒感染中的表达及临床意义

目的探讨Th17、Treg细胞在小儿EB病毒感染中的表达及临床意义。方法选取秦皇岛市第一医院2019年12月至2020年8月儿科门诊及病房就诊(复诊)的66例EB病毒感染患儿作为观察组,另外选取同期于我院参加体检的健康儿童60例作为对照组。采用酶联免疫法(ELISA)和荧光定量PCR方法检测EB病毒抗体及EB病毒DNA,分析阳性感染率。进一步采用流式细胞术及ELISA,检测外周血T淋巴细胞中Th17、Treg细胞及其相关特征性细胞因子(IL-17、TGF-β)的水平变化,对其进行分析、总结。采用RT-PCR法对Treg表达叉头翼状螺旋转录因子(Forkhead pterygoid transcription factor,Foxp3)mRNA与Th17表达孤核受体(Nosoluclear receptor,RORγt)mRNA的表达水平进行检测分析。比较对照组与观察组外周血Treg细胞及Th17细胞百分率;比较对照组与观察组Foxp3mRNA及RORγtmRNA表达水平;比较初治组与缓解组外周血Treg细胞及Th17细胞百分率、Foxp3mRNA及RORγtmRNA表达水平。结果(1)观察组外周血Treg细胞百分率显著低于对照组(P<0.01),观察组外周血Th17细胞百分率显著高于对照组(P<0.01);(2)观察组外周血Foxp3mRNA表达水平显著小于对照组(P<0.01),观察组外周血RORγtmRNA表达水平显著大于对照组(P<0.01);(3)缓解组外周血Treg细胞百分率、Foxp3mRNA表达水平均显著高于初治组(P均<0.05),缓解组外周血Th17细胞百分率、RORγtmRNA表达水平均分别显著低于初治组(P均<0.01)。结论Treg/Th17细胞在EBV感染的相关疾病发病过程中扮演重要的角色,强化对患儿外周血Treg/Th17细胞水平的监测,能够为EBV感染相关性疾病病情及临床治疗效果评估提供重要依据。

Survivin在中线T细胞淋巴瘤中的表达及其与EB病毒感染的关系

为了探讨凋亡抑制基因存活蛋白(survivin)在中线T细胞淋巴瘤(midlineTcelllymphoma,MTL)中的表达及其与EB病毒(EpstinBarrvirus,EBV)感染的关系,应用免疫组织化学方法检测石蜡切片中存活蛋白和EBV潜伏膜蛋白(latentmembraneprotein,LMP1)的表达,采用原位分子杂交技术检测EBV编码的RNA(EBVencodedRNA,EBER1/2)。结果表明:41例MTL中26例存活蛋白阳性表达(63.42%),而在10例反应性增生淋巴组织中均未检测出存活蛋白表达;存活蛋白在低度恶性MTL中的阳性表达率为12.50%,在中高度恶性MTL中的阳性表达率为75.76%,两组之间的差异具有显著性的意义(χ2=8.55,P<0.01);EBER1/2阳性率为70.73%,LMP1阳性率为41.46%,EBV阳性组与EBV阴性组之间存活蛋白的表达差异无显著性意义(P>0.05)。结论:MTL组织中存活蛋白表达上调,存活蛋白表达阳性率与MTL的恶性程度有关,存活蛋白基因可能通过肿瘤细胞凋亡的抑制参与MTL的发生发展,但未发现存活蛋白表达与EBV感染之间有明显相关性。

EB病毒包膜糖蛋白gp85真核表达载体的构建

用基因工程技术克隆EB病毒中抗原性较强的膜蛋白gp85的编码基因BXLF2,构建真核表达载体。以EB病毒B95-8细胞培养上清为模板,PCR扩增出BXLF2基因。PCR产物经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切后克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。重组质粒双酶切的片段大小与预期符合,重组克隆外源基因的测序结果与文献报道一致。结果表明,EB病毒gp85的编码基因BXLF2被成功地克隆入真核表达载体pPIC9K,为下一步在毕赤酵母中表达EB病毒gp85蛋白建立了基础。

RNA干扰对鼻咽癌EB病毒抑制作用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)介导的,特异性地降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)现象,广泛存在于真菌、植物、线虫、病毒、小鼠等多种生物中,是一种有广泛应用前景的抗病毒感染的基因治疗方法。目前,RNAi已应用于EB病毒阳性的鼻咽癌细胞干扰中,并取得了满意的效果。

lncRNA HOTAIR 和H19 SNPs与胃癌及EB病毒相关胃癌遗传易感性的关系

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)H19及HOTAIR基因多态性与胃癌和EB病毒相关胃癌(EBVaGC)易感性的关系。方法:研究对象选择EB病毒阴性胃癌(EBVnGC)组织65例、EBVaGC组织50例及115例健康人外周血标本,并从中提取其DNA备用。选择H19 rs3024270和rs3741219,以及HOTAIR rs4759314和rs874945共4个基因多态性位点,利用Taq-Man MGB等位基因分型试剂盒对各单核苷酸多态性(SNP)位点基因进行分型,统计分析实验结果。结果:H19及HOTAIR的SNPs在全部标本中均符合Hardy-Weinberg平衡。(1)H19 rs3024270位点的SNP在胃癌组与对照组中的差异有统计学意义(P<0.05);其中G等位基因为保护基因,个体携带G等位基因可显著降低罹患胃癌的风险(P<0.01);(2)HOTAIR rs4759314位点在胃癌组与对照组中基因型和等位基因分布频率均有显著差异(P<0.05);基因型为GG的人群,胃癌的发病风险显著增加(P<0.05);且胃癌的风险基因可能是G等位基因,携带G等位基因人群罹患胃癌的风险显著增加(P<0.05);(3)H19 rs3741219及HOTAIR rs874945位点的各基因型及等位基因频率在两组间无显著差异(P>0.05);(4)HOTAIR rs4759314位点G等位基因在EBVaGC组的分布高于EBVnGC组,而EBVaGC和EBVnGC组间其他SNPs的分布差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:H19 rs3024270和HOTAIR rs4759314位点的SNPs与胃癌的发病风险有关,但与EBVaGC的发病风险之间未观察到明确的关联性。

应用流式-荧光原位杂交协助鉴别诊断EB病毒感染的淋巴细胞亚群

目的:建立流式细胞术-荧光原位杂交联用技术(Flow-FISH),探讨Flow-FISH技术在临床EB病毒(Epstein-Barr virus)感染性疾病中感染细胞亚型鉴定的临床前诊断价值。方法:通过Ficoll-paque离心分离法收集重庆医科大学附属儿童医院招募的9例EBV感染患者的外周血标本中单个核细胞;通过qRT-PCR检测细胞EBER1及EBER2表达;通过荧光标记抗体对细胞表面标志物进行检测,经固定破膜剂对标记后细胞进行固定及破膜处理后与FISH探针37℃条件下过夜杂交,通过流式细胞仪、荧光显微镜检测细胞状态、表面抗原染色以及FISH探针与靶mRNA的结合。结果:优化固定破膜剂配方,建立0.2%Tween-20 4℃破膜15 min为破膜条件,此条件对细胞状态及表面抗原影响小,不干扰流式细胞术对细胞亚群判定。优化杂交液配方,探明20%甲酰胺和7%硫酸葡聚糖在37℃过夜条件下杂交为最优杂交条件,此条件下细胞形态及流式分群好,探针杂交效果佳。通过使用Flow-FISH技术能特异性区分各EBV;以及EBV;淋巴细胞系。通过Flow-FISH技术,成功鉴定临床外周血标本中的EBV;淋巴细胞亚群。结论:初步建立流式细胞术-荧光原位杂交联用检测EBV感染细胞亚群技术,为其进一步的临床前实验奠定基础。

器官移植受者EB病毒感染和移植后淋巴组织增生性疾病临床诊疗规范(2019版)

为了进一步规范中国实体器官移植(SOT)受者EB病毒(EBV)感染和移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)的诊断和治疗,中华医学会器官移植学分会组织器官移植专家、感染病学专家、血液内科专家,在《器官移植受者EBV感染和PTLD临床诊疗指南(2016版)》的基础上,从概述和流行病学特点、临床表现、诊断、预防、治疗、预后、存在的问题及展望等方面,制订本规范,以帮助器官移植工作者规范和优化EBV感染及相关疾病PTLD的诊断和治疗。

冷冻组织对EB病毒原位杂交检测的影响

目的探讨EB病毒(EBV)原位杂交检测在组织冷冻切片检测中的效果。方法收集2017-01—2019-12北京同仁医院病理科收检的同一病例经冷冻和未冷冻的标本,均行EBV编码的小RNA转录产物(EBV-encoded RNA,EBER)原位杂交92例,对结果进行回顾性分析。结果92例发病年龄为6~81岁,平均年龄47±16岁。男性62例,女性30例。冷冻过的组织与未冷冻的组织在EBER原位杂交的检测中一致率为93.5%,检测结果不完全一致的有6例,占6.5%。其中与鼻咽癌有关的4例,淋巴组织反应性增生1例,淋巴上皮癌1例。经冷冻和未经冷冻的标本EBER原位杂交检测结果一致为阳性的共38例(占41.3%),分别为鼻咽癌24例,不除外EB病毒感染相关淋巴组织增生性病变1例,NK/T淋巴瘤11例,淋巴上皮癌2例。经冷冻和未经冷冻的标本EBER原位杂交检测一致为阴性的共48例,占总病例数的52.2%。分别为淋巴瘤(非NK/T淋巴瘤)13例,淋巴组织反应性增生26例,非角化鳞状细胞癌4例,NUT癌1例,纤维型骨肉瘤1例,单相型滑膜肉瘤1例,Wegener肉芽肿1例,淋巴上皮癌1例。结论未经冷冻的组织EBER原位杂交检测效果优于经过冷冻的标本,在诊断鼻咽癌等需特别关注EBV表达情况的疾病时,一定要结合经冷冻和未经冷冻的标本检测结果综合评估,建议优先选用未经冷冻的标本进行检测。

EB病毒基因片段表达水平与鼻咽癌发病的关系

目的探讨BCRF-1 mRNA表达水平与鼻咽癌发病相关性及其对免疫功能的影响。方法选取2017年1月~2018年5月于长沙市第一医院(以下简称“我院”)就诊的54例鼻咽癌患者(鼻咽癌组)作为研究对象,选取我院同期就诊的50例非肿瘤性鼻咽患者作为对照组。采用实时荧光定量PCR检测BCRF-1 mRNA的表达水平,采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群。结果与对照组比较,鼻咽癌组BCRF-1 m RNA相对表达显著升高(P <0.05);TNM分期T3~T4期、N2~N3期鼻咽癌BCRF-1 mRNA相对表达量明显高于T1~T2期、N0~N1期(P <0.05);BCRF-1 mRNA高表达组CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+明显低于BCRF-1 mRNA低表达组,而CD8+T细胞比例明显高于BCRF-1 mRNA低表达组(均P <0.05)。结论 BCRF-1 m RNA表达可能与鼻咽癌TNM分期T、N有关,同时其高表达对患者免疫功能有抑制作用。