EB病毒编码的小mRNA阴性结外NK/T细胞淋巴瘤的临床特征及预后分析

背景与目的:结外NK/T细胞淋巴瘤(extranodal natural killer/T-cell lymphoma,ENKTL)为非霍奇金淋巴瘤的一个亚型,中国发病率远高于西方国家。该病恶性程度高,对化疗不敏感,生存期短,预后差,EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染与该病的发生、发展有密切关系,但仍有少数患者无EBV感染。本研究探讨EBV编码的小m RNA(EBV-encoded small RNA,EBER)原位杂交阴性患者的临床特征及预后相关因素。方法:选取2011年8月—2015年10月郑州大学第一附属医院病理科诊断为ENKTL的326例标本,采用原位杂交技术检测其EBER表达,回顾性分析8例EBER阴性患者临床特征及预后相关因素。结果:326例ENKTL中,EBER表达阴性率为2.45%(8/326),8例EBER表达阴性患者的中位生存期为17个月。EBER阴性与EBER阳性患者的生存率log-rank检验,两条生存曲线差异有统计学意义(χ2=6.407,P=0.011)。多变量Cox比例风险回归分析表明,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)与EBER阴性ENKTL患者预后有关(P=0.008),血浆中EBV-DNA拷贝数与EBER阴性患者的预后无关(P>0.05)。结论:EBER表达阴性ENKTL发病率低,预后较EBER阳性患者差,LDH升高可能是其预后不良因素。

EB病毒相关胃癌迁移、侵袭相关miRNA和lncRNA研究进展

胃癌是全球第五大常见恶性肿瘤,死亡率居肿瘤相关死亡的第3位。EB病毒(EBV)感染在人群中非常普遍,与各种人类肿瘤有关,如鼻咽癌、胃癌和淋巴瘤,其中EB病毒相关胃癌(EBVaGC)约占所有胃癌的1.3%~30.9%。在EBV相关肿瘤中,许多非编码RNA(ncRNA)参与了肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等过程的调控,ncRNA与潜在靶基因的相互作用逐渐成为研究热点。文章综述了与胃癌迁移、侵袭相关的ncRNA的研究进展,以期为后续胃癌的研究提供参考。

EB病毒编码的小RNA荧光双重标记技术的建立

目的利用原位杂交联合免疫荧光建立EB病毒编码的小RNA(EBER)的荧光双重标记方法。方法收集2018年12月至2019年11月于首都医科大学附属北京友谊医院病理科诊断为淋巴瘤患者的蜡块20例,其EBER原位杂交检测结果均为阳性。每例取蜡块进行连续切片,每例切片2张,其中1张切片进行荧光双重标记,另1张作为阴性对照。通过荧光显微镜查看双重荧光标记的效果。结果荧光双重标记成功后细胞和组织结构完整。原位杂交联合免疫荧光阳性的细胞核呈绿色荧光,免疫荧光阳性的细胞膜呈红色荧光,双重标记阳性细胞的膜与核红绿荧光对比鲜明。结论建立了一种新的EBER荧光双重标记方法,且此方法可以用于判断EB病毒感染的细胞属于B细胞还是T细胞,有助于淋巴瘤的诊断。

lncRNA HOTAIR 和H19 SNPs与胃癌及EB病毒相关胃癌遗传易感性的关系

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)H19及HOTAIR基因多态性与胃癌和EB病毒相关胃癌(EBVaGC)易感性的关系。方法:研究对象选择EB病毒阴性胃癌(EBVnGC)组织65例、EBVaGC组织50例及115例健康人外周血标本,并从中提取其DNA备用。选择H19 rs3024270和rs3741219,以及HOTAIR rs4759314和rs874945共4个基因多态性位点,利用Taq-Man MGB等位基因分型试剂盒对各单核苷酸多态性(SNP)位点基因进行分型,统计分析实验结果。结果:H19及HOTAIR的SNPs在全部标本中均符合Hardy-Weinberg平衡。(1)H19 rs3024270位点的SNP在胃癌组与对照组中的差异有统计学意义(P<0.05);其中G等位基因为保护基因,个体携带G等位基因可显著降低罹患胃癌的风险(P<0.01);(2)HOTAIR rs4759314位点在胃癌组与对照组中基因型和等位基因分布频率均有显著差异(P<0.05);基因型为GG的人群,胃癌的发病风险显著增加(P<0.05);且胃癌的风险基因可能是G等位基因,携带G等位基因人群罹患胃癌的风险显著增加(P<0.05);(3)H19 rs3741219及HOTAIR rs874945位点的各基因型及等位基因频率在两组间无显著差异(P>0.05);(4)HOTAIR rs4759314位点G等位基因在EBVaGC组的分布高于EBVnGC组,而EBVaGC和EBVnGC组间其他SNPs的分布差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:H19 rs3024270和HOTAIR rs4759314位点的SNPs与胃癌的发病风险有关,但与EBVaGC的发病风险之间未观察到明确的关联性。

136例中国北方汉族人群经典型霍奇金淋巴瘤与EB病毒感染的相关性研究

目的：EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染与多种肿瘤的发生关系密切，现已证实EBV感染与经典型霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin lymphoma，CHL）发生关系尤为密切，但CHL患者中EBV检出率因种族、地域、性别和年龄的不同而有所差异，本研究目的在于探讨中国北方地区CHL发病与EBV感染的相关性。方法：用原位杂交的方法检测136例确诊为CHL病例中EBV编码的小RNA（Epstein-Barr virus encoded RNA，EBER）。结果：在136例CHL患者中EBER的总阳性率为28%（37/136），其中混合细胞型（mixed cellularity，MC）阳性率最高为49%（23/47）（P〈0.001），其次为富于淋巴细胞型（1ymphocyte rich，LR）30%（3/10），结节硬化型（nodular sclerosis，NS）14%（10/73），淋巴细胞消减型（1ymphocyte depletion，LD）0例（0/2）。CHL发病年龄呈单峰分布，主要在21～30岁年龄组。NS型在21～30年龄组出现一个明显单峰，而MC型在41～50岁年龄组存在一个略低的峰，EBER阳性率在0～10岁和41～50岁这两个年龄组分别有两个峰值（21.6%和24.3%）。结论：中国北方汉族人群CHL的发病与EBV的感染有一定的关系，其中以MC与EBV的关系较为密切。

骨髓活检在EBER原位杂交检测中消化时间的优化

目的优化骨髓活检样本在EB病毒编码的小RNA(EBER)原位杂交检测中的消化时间。方法对20例EB病毒相关疾病的骨髓活检样本,连续切片3张,分为3组,使用同一浓度的蛋白酶K,对3组切片进行间隔5 min的梯度时间消化,然后继续进行EBER原位杂交的其它检测步骤,并对结果进行判读。结果消化时间为10 min组的切片,杂交效果最好,组织结构完整,阳性细胞着色深,定位准确,背景干净,结果清晰易辨。结论骨髓活检样本与其他活检组织相比,在EBER原位杂交检测中的消化时间要适当延长,以10 min最佳。

Survivin在中线T细胞淋巴瘤中的表达及其与EB病毒感染的关系

为了探讨凋亡抑制基因存活蛋白(survivin)在中线T细胞淋巴瘤(midlineTcelllymphoma,MTL)中的表达及其与EB病毒(EpstinBarrvirus,EBV)感染的关系,应用免疫组织化学方法检测石蜡切片中存活蛋白和EBV潜伏膜蛋白(latentmembraneprotein,LMP1)的表达,采用原位分子杂交技术检测EBV编码的RNA(EBVencodedRNA,EBER1/2)。结果表明:41例MTL中26例存活蛋白阳性表达(63.42%),而在10例反应性增生淋巴组织中均未检测出存活蛋白表达;存活蛋白在低度恶性MTL中的阳性表达率为12.50%,在中高度恶性MTL中的阳性表达率为75.76%,两组之间的差异具有显著性的意义(χ2=8.55,P<0.01);EBER1/2阳性率为70.73%,LMP1阳性率为41.46%,EBV阳性组与EBV阴性组之间存活蛋白的表达差异无显著性意义(P>0.05)。结论:MTL组织中存活蛋白表达上调,存活蛋白表达阳性率与MTL的恶性程度有关,存活蛋白基因可能通过肿瘤细胞凋亡的抑制参与MTL的发生发展,但未发现存活蛋白表达与EBV感染之间有明显相关性。

荧光原位杂交和原位杂交联合免疫荧光检测EBER的可行性比较

目的探讨利用荧光原位杂交(FISH)和原位杂交(ISH)联合免疫荧光(IF)两种方法检测EB病毒编码的小RNA(EBER)的可行性。方法收集首都医科大学附属北京友谊医院病理科2016年7月至2017年1月诊断的淋巴瘤患者20例,EBER原位杂交检测均为阳性。每例取蜡块进行切片,每张厚3μm,4张连续切片分为四组:荧光原位杂交及其阴性对照,原位杂交联合免疫荧光及其阴性对照。通过荧光显微镜查看两种荧光方法的效果。结果利用荧光原位杂交与原位杂交联合免疫荧光的方法检测EBER,均可以使EBER阳性细胞显示出阳性绿色荧光信号,且阴性对照无阳性荧光信号。后者更敏感,背景更少。结论荧光原位杂交与原位杂交联合免疫荧光这两种方法都可以有效地应用于EBER的检测,且这两种方法可能会成为EB病毒相关疾病诊断的实验室检查方法。

青岛地区汉族人群中lncRNA H19的多态性与胃癌和EBV相关胃癌易感性的关系

目的:探讨青岛地区汉族人群lncRNA H19单核苷酸多态性(SNP)与胃癌和EBV相关胃癌(EBVaGC)易感性的关系。方法:收集青岛地区汉族人群2015年1月至2018年10月青岛大学附属医院经病理科确诊为胃癌的新鲜组织或陈旧的石蜡包埋胃癌组织病理标本共225例,为胃癌组;依据原位杂交法对EBV编码的小分子非多聚腺苷酸(EBER1)转录检测结果再将胃癌组分为2亚组:EBVaGC组70例,EBVnGC组155例;同时选择青岛大学附属医院门诊健康体检者200例为对照组。提取EBVaGC、EBVnGC组织及健康人群外周血标本的DNA,根据HaploView软件常规设置原则(MAF>0.05;r2>0.8)筛选出rs217727、rs2735971、rs2839698和rs3741216四个H19的TagSNPs。利用Taq-Man MGB等位基因分型试剂盒对各SNP位点基因进行基因分型,并进行基因多态性检测。结果:所取标本的H19 SNPs均符合Hardy-Weinberg平衡。与对照组比较,胃癌组H19 rs217727位点TT基因型的发病风险显著增加(χ~2=9.073, P=0.003, OR=1.999, 95%CI=1.271~3.143),等位基因T的分布也明显增高(χ~2=13.475, P=0.001, OR=1.661, 95%CI=1.266~2.180);H19 rs2839698位点TC、CC基因型人群可显著增加胃癌的发病风险(χ~2=9.407,P=0.002;χ~2=6.517, P=0.011),携带C等位基因人群罹患胃癌的风险明显增加(χ~2=6.163, P=0.013, OR=1.417, 95%CI=1.076~1.867;χ~2=9.542, P=0.02, OR=2.070, 95%CI=1.298~3.302)。但胃癌组H19 rs2735971和rs3741216位点基因多态性与对照组比较差异不明显(均P>0.05);EBVaGC和EBVnGC组中H19的4个位点基因多态性分布差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:H19rs217727、rs2839698基因多态性可能与胃癌发病风险有关,携带TT基因型C等位基因和人群胃癌的发病风险明显升高;H19SNP的多态性与EBVaGC的发病风险无明显相关。

器官移植受者EB病毒感染和移植后淋巴组织增生性疾病临床诊疗规范(2019版)

为了进一步规范中国实体器官移植(SOT)受者EB病毒(EBV)感染和移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)的诊断和治疗,中华医学会器官移植学分会组织器官移植专家、感染病学专家、血液内科专家,在《器官移植受者EBV感染和PTLD临床诊疗指南(2016版)》的基础上,从概述和流行病学特点、临床表现、诊断、预防、治疗、预后、存在的问题及展望等方面,制订本规范,以帮助器官移植工作者规范和优化EBV感染及相关疾病PTLD的诊断和治疗。

变异型EBER2通过抑制PKR通路增强鼻咽癌细胞抗凋亡能力

目的:前期研究发现变异型EB病毒编码小RNA 2(EBER2)基因EB-8m可能与鼻咽癌(NPC)相关,本研究旨在探讨变异型EBER2是否通过增强对RNA激活蛋白激酶(PKR)的抑制作用从而提高NPC细胞的抗凋亡能力。方法:以野生型和EB-8m变异型EBER2基因稳定转染的EB病毒阴性NPC细胞系HONE1和CNE1为研究对象,以未转染EBER2基因细胞为对照,分别用10 000 IU/mLα-干扰素(IFN-α)和2μg/mL顺铂诱导凋亡后以流式细胞术检测细胞凋亡;采用Western blot检测IFN-α诱导凋亡细胞中PKR及下游eIF2α和c-Jun的磷酸化蛋白及Bcl-2蛋白表达水平。对EBER2基因转染细胞进行RNA和PKR蛋白免疫共沉淀,检测共沉淀产物中EBER2富集倍数。结果:EBER2基因转染细胞的凋亡率低于未转染EBER2基因细胞(P<0.05或P<0.01),且变异型的细胞凋亡率低于野生型(P<0.05)。与未转染EBER2基因细胞比较,EBER2转染细胞中磷酸化PKR、eIF2α和c-Jun减少,Bcl-2表达升高,且磷酸化PKR在变异型转染HONE1和CNE1细胞中的水平低于野生型转染细胞,磷酸化eIF2α在变异型转染HONE1细胞中的水平亦低于野生型转染细胞,差异均有统计学意义(P均<0.05)。EBER2基因转染细胞RNA和PKR免疫共沉淀产物中可检测到EBER2,且变异型的富集倍数高于野生型(P<0.05)。结论:EB-8m变异型EBER2可能增强EBER2对PKR的结合作用,同时抑制eIF2α和c-Jun磷酸化并上调Bcl-2表达,进而增强NPC细胞抗凋亡能力。

应用流式-荧光原位杂交协助鉴别诊断EB病毒感染的淋巴细胞亚群

目的:建立流式细胞术-荧光原位杂交联用技术(Flow-FISH),探讨Flow-FISH技术在临床EB病毒(Epstein-Barr virus)感染性疾病中感染细胞亚型鉴定的临床前诊断价值。方法:通过Ficoll-paque离心分离法收集重庆医科大学附属儿童医院招募的9例EBV感染患者的外周血标本中单个核细胞;通过qRT-PCR检测细胞EBER1及EBER2表达;通过荧光标记抗体对细胞表面标志物进行检测,经固定破膜剂对标记后细胞进行固定及破膜处理后与FISH探针37℃条件下过夜杂交,通过流式细胞仪、荧光显微镜检测细胞状态、表面抗原染色以及FISH探针与靶mRNA的结合。结果:优化固定破膜剂配方,建立0.2%Tween-20 4℃破膜15 min为破膜条件,此条件对细胞状态及表面抗原影响小,不干扰流式细胞术对细胞亚群判定。优化杂交液配方,探明20%甲酰胺和7%硫酸葡聚糖在37℃过夜条件下杂交为最优杂交条件,此条件下细胞形态及流式分群好,探针杂交效果佳。通过使用Flow-FISH技术能特异性区分各EBV;以及EBV;淋巴细胞系。通过Flow-FISH技术,成功鉴定临床外周血标本中的EBV;淋巴细胞亚群。结论:初步建立流式细胞术-荧光原位杂交联用检测EBV感染细胞亚群技术,为其进一步的临床前实验奠定基础。

冷冻组织对EB病毒原位杂交检测的影响

目的探讨EB病毒(EBV)原位杂交检测在组织冷冻切片检测中的效果。方法收集2017-01—2019-12北京同仁医院病理科收检的同一病例经冷冻和未冷冻的标本,均行EBV编码的小RNA转录产物(EBV-encoded RNA,EBER)原位杂交92例,对结果进行回顾性分析。结果92例发病年龄为6~81岁,平均年龄47±16岁。男性62例,女性30例。冷冻过的组织与未冷冻的组织在EBER原位杂交的检测中一致率为93.5%,检测结果不完全一致的有6例,占6.5%。其中与鼻咽癌有关的4例,淋巴组织反应性增生1例,淋巴上皮癌1例。经冷冻和未经冷冻的标本EBER原位杂交检测结果一致为阳性的共38例(占41.3%),分别为鼻咽癌24例,不除外EB病毒感染相关淋巴组织增生性病变1例,NK/T淋巴瘤11例,淋巴上皮癌2例。经冷冻和未经冷冻的标本EBER原位杂交检测一致为阴性的共48例,占总病例数的52.2%。分别为淋巴瘤(非NK/T淋巴瘤)13例,淋巴组织反应性增生26例,非角化鳞状细胞癌4例,NUT癌1例,纤维型骨肉瘤1例,单相型滑膜肉瘤1例,Wegener肉芽肿1例,淋巴上皮癌1例。结论未经冷冻的组织EBER原位杂交检测效果优于经过冷冻的标本,在诊断鼻咽癌等需特别关注EBV表达情况的疾病时,一定要结合经冷冻和未经冷冻的标本检测结果综合评估,建议优先选用未经冷冻的标本进行检测。

EB病毒相关肿瘤中EB病毒编码微小RNA的研究进展

EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）又称人类疱疹病毒4，是一种线性双链DNA病毒，在人群中广泛感染，与淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类存在于多种真核生物和DNA病毒中的非编码RNA，长度为19—25nt，以碱基互补的方式和靶标mRNA的3‘端非翻译区（3’UTR）结合，导致靶标mRNA的翻译抑制或降解”。EBV是首个被发现可以编码miRNA的病毒。2013年6月miRbase数据库（www．mirbase．org）公布的数据显示，至今已经发现EBV编码的25个前体miRNA和44个成熟miRNA。EBVmiRNA主要由EBV基因组中的BHRF1和BART两个区域编码。BHRFl（Bam HI fragment H rightward open reading frame1）编码3个前体miRNA（ebv—miR—BHRF1-1，-2，-3）和4个成熟miRNA。BART（The Bam H I A region rightward transcript）编码两组包括22个前体miRNA和40个成熟miRNA：第1组位于BART外显子I和IB之间，编码8个前体miRNA（ebv-miR—BART1，-BART3-6，-BART15～17）；第2组位于BART外显子IB和Ⅲ之间，编码13个前体miRNA（ebv—miR—BART7-14，-BART18-22）。ebv—miR—BART2则由BART外显子Ⅳ和V之间的区域编码。越来越多的证据表明，EBVmiRNA在调节EBV和宿主的基因表达并促进EBV相关肿瘤的发生发展方面发挥着重要的作用”。

液态阳性对照在EB病毒编码小RNA原位杂交染色质量控制中的应用

EB病毒编码小RNA（ EBER）原位杂交在病理工作中应用十分广泛，但最让医师担心的是由于各种原因引起的假阴性，在无阳性对照的情况下无法判别染色是否成功，极易引起误诊，导致临床治疗方案的不同，造成无法挽回的后果。但由于现有的阳性对照方法费时、费力、步骤繁琐，在很多实验室都没有很好的普及应用。近年来，我们找到了一种简单、快捷、方便、容易制备的液态阳性对照方法应用于免疫组织化学染色［1］，通过反复实验，我们在EBER原位杂交实验中也取得了满意的结果，现介绍如下。

EB病毒感染与肺癌患者临床特征的相关性

目的探讨EB病毒(EBV)相关肺癌的临床特征。方法采用原位杂交法检测108例手术切除肺癌标本和22例癌旁正常组织的EBV编码小RNA1(EBER-1)的表达。结果肺癌标本中EBER-1阳性率为33.3%,高于癌旁正常肺组织的4.5%(P<0.01)。右肺癌EBER-1阳性率为40.3%,高于左肺癌的19.4%(P<0.05)。77例鳞癌和腺癌中,高、中、低分化癌的EBER-1阳性率分别为8.3%、47.2%、27.6%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EBV感染可能与肺癌的发病部位、分化程度相关。

2例原发性肺淋巴上皮瘤样癌临床病理特征分析

目的分析肺淋巴上皮瘤样癌(LELC)的临床病理学特征、诊断及鉴别诊断,以提高临床诊断准确性。方法分析2019年4—9月长沙市中心医院诊治的2例肺LELC临床病理特征,复阅全部苏木精-伊红(HE)切片及免疫组化切片,复习相关文献。结果2例肺LELC镜下形态表现类似,低倍镜下肿瘤边界较清晰,呈推挤样及浸润性生长。高倍下肿瘤细胞体积大,胞界不清,细胞质丰富、淡染,胞核呈空泡状,核仁明显。患者2部分区域肿瘤细胞实性成片,排列紧密,淋巴细胞稀少,表现出非经典病理形态。免疫标记表达一致,肿瘤细胞细胞角蛋白(CK)、P40、P63、细胞角蛋白5(CK5)表达均为阳性,甲状腺转录因子-1(TTF1)、新天冬氨酸蛋白酶A(Napsin A)、CD56、嗜铬素A(CgA)、突触素(Syn)表达均为阴性。EB病毒编码的小RNA(EBER)均阳性。结论肺LELC相对罕见,病理医师需仔细观察其形态学特征,注意鉴别诊断,合理应用免疫标记,并完善EBER检测,可获得正确诊断。

Skp2在鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

目的探讨Skp2与鼻型NK/T细胞淋巴瘤的预后及其他临床特点之间的关系。方法收集95例鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者临床病理学资料,用免疫组化方法检测肿瘤石蜡包埋标本的EB病毒编码RNA(EBV encoded RNA,EBER)、Skp2及Ki-67的表达情况,将Skp2阳性细胞比率超过50%的病例计入高表达组,低于50%的计入低表达组,分析患者的预后、EBER表达状态与Skp2、Ki-67表达率之间的关系。结果在Skp2高表达组,中位生存期为20.54个月(95%CI:18.49-22.59),1年总体生存率为76%;在Skp2低表达组,中位生存期为17.54个月(95%CI:20.31-22.24),1年总体生存率为71%;在Skp2阴性组,中位生存期为个21.71个月(95%CI:11.15-16.18),1年总体生存率为91%。生存分析显示,Skp2高表达组与Skp2阴性组间差异具有统计学意义(P=0.035)。结论 Skp2的高表达可能是鼻腔NK/T细胞淋巴瘤预后的不良因素。