EBV转化的人乳头瘤病毒感染者B淋巴母细胞系的建立及应用

建立EB病毒(EBV)转化的B淋巴母细胞系(LCL),应用此细胞系作为抗原递呈细胞筛选抗原特异性的T细胞克隆。收集人乳头瘤病毒(HPV)感染者外周血20份,分离外周血单个核细胞(PBMC),利用Pan T细胞试剂盒去除PBMC中的T细胞,获得non-T淋巴细胞,EBV病毒转化non-T淋巴细胞。应用转化的LCL细胞作为抗原递呈细胞,ELISPOT筛选可能的HPV抗原特异性的T细胞克隆。成功建立18个LCLs,建株成功率为90%。转化成功的LCL细胞体积增大,聚集成团状或簇状。建株失败的两份标本,用于转化的non-T淋巴细胞数少于2×106。应用LCL细胞作为抗原递呈细胞筛选出64个HPV抗原特异性的T细胞克隆。成功建立LCLs,此细胞系细胞可作为体外研究HPV特异性免疫反应的刺激细胞。

应用微量冻存法建立EB病毒转化脐带血淋巴母细胞系

目的应用微量冻存法建立EB病毒(EBV)转化脐带血淋巴母细胞系(LCLs),为永久保存具遗传疾病的脐带血资源提供研究基础。方法知情同意下收集妊娠中期至晚期终止妊娠的20例孕妇脐带血样本,采用微量冻存法,通过EBV转化获得脐带血LCLs,冻存复苏后,染色体G显带分析,检测建系前后的核型稳定性。结果 20例样本中19例成功进行微量冻存法转化,成功率95%,转化成功的脐带血LCLs冻存后复苏成功率达100%。除1例因胎儿为水肿胎失败外,19例脐带血样本均可在10 d左右观察到淋巴细胞增大呈母细胞化,增殖的淋巴母细胞凝聚成团,6~8周后可获得稳定生长的脐带血LCLs,转化前后的淋巴细胞染色体核型无明显差异。结论应用微量冻存法可成功建立脐带血LCLs,EB病毒转化的脐带血LCLs细胞遗传学特性稳定,可用于进一步的遗传学研究。

建立EB病毒转化B淋巴母细胞系的一种新方法——微量冻存全血法

本文报道了一种微量冻存全血法建立 EB 病毒转化 B 淋巴母细胞系的新方法。此方法不同于常规方法在于:用血量少(0.5ml);冻存的全血不需分离 B 淋巴细胞;不需用环孢霉素 A(Cyclosporine A.CyA),并且建系所需时间短。笔者从用此方法建立的细胞系中提取DNA,并用于 RFLP 连锁分析。此方法对遗传学研究有重要意义。

EBV转化慢性乙型肝炎患者B淋巴母细胞系的建立

目的体外建立慢性乙型肝炎患者永生化的B淋巴母细胞系(LCL)。方法用EB病毒感染自慢性乙型肝炎患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpGDNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察LCL的形态特征,利用流式细胞术分析LCL细胞膜表面分子CD19和CD23的表达水平。结果46例患者PBMC经EBV感染4周后,42例转化成永生化B淋巴母细胞系,成功率为91.3%。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。结论转化后的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。

EB病毒转化B淋巴母细胞在汉滩病毒CTL表位研究中的应用

目的:建立EB病毒转化B淋巴母细胞系(B-LCL),作为抗原提呈细胞(APC)提呈抗原肽,刺激短期培养的特异性T细胞活化并分泌IFN-γ,从而应用于T细胞表位鉴定中。方法:用B95-8细胞培养上清中的EB病毒转化肾综合征出血热(HFRS)患者PBMC,建立HFRS患者的B-LCL,以自身B-LCL为APC,加载抗原肽后,刺激短期培养的G9L特异的HFRS患者CD8+T细胞系,应用ELISPOT测定CD8+T细胞受到抗原肽刺激后产生IFN-γ的能力。结果:加载过抗原肽G9L或V15R的B-LCL可刺激G9L特异的CD8+T细胞活化并产生IFN-γ,而与G9L无同源序列的I15P则不能刺激G9L特异的CD8+T细胞活化。结论:B-LCL可作为非专职APC有效地将抗原肽提呈给特异性T细胞。

CpG基序联合EB病毒建立永生化B淋巴母细胞系

目的体外建立慢性乙型肝炎患者永生化的B淋巴母细胞系(LCLs)。方法用EB病毒感染自慢性乙型肝炎患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19和CD23的表达水平。结果46例患者PBMC经EBV感染4周后,42例转化成永生化B淋巴母细胞系,成功率为91.3%。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。结论CpG免疫调节基序联合EBV感染人PBMC,提高转化效率,转化后的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。

乙型肝炎患者EBV转化B淋巴母细胞系的建立及其特点

为研究乙型肝炎患者EBV转化的B淋巴母细胞系的特征 ,并为进一步研究乙型肝炎患者细胞免疫功能奠定基础。采用丁酸钠诱导B95 8细胞产生高滴度EBV ,并感染A(ATL比正常升高 2倍 )、B(ATL正常 )两组乙型肝炎患者外周血单个核细胞。结果表明 ,EBV感染后 4～ 8周 ,建立了 19例乙型肝炎患者的永生化B淋巴母细胞系 ,A组患者的B细胞形成集落的时间明显晚于B组 2～ 3周 ;细胞系冻存复苏后 ,活性良好 :分别有 88 34%和 37 48%的永生化B细胞膜上表达CD19和CD2 0 ;永生化的B细胞中检测不到HBVDNA。提示乙型肝炎患者永生化B淋巴母细胞系的建立时间与患者免疫状态有关 ;B细胞永生化后 ,HBVDNA不能在细胞内持续存在 。

EB病毒相关淋巴母细胞样细胞系的建立及鉴定

目的由于EB病毒与肿瘤的关系极为复杂且存在争议,淋巴母细胞样细胞系LCLs(lymphoblastoid celllines)没有肿瘤形成过程中的复杂因素,从而成为了研究EBV介导的细胞永生化的最佳模型。本实验旨在建立EBV原型株相关的永生化淋巴母细胞系,为后期LCLs的端粒酶活性及其体内外成瘤性的相关研究提供基础。方法利用体外培养B95.8细胞产生EB病毒原型株感染正常人外周血淋巴细胞培养传代得到5株EB病毒相关淋巴母细胞,并用RT-PCR对其进行了基因表达、流式细胞仪进行细胞表面标记以及核型的鉴定。结果淋巴母细胞样细胞系能不断传代,能表达EBV基因,具有成熟B细胞表面标记;细胞传代过程早期未发生核型改变。结论建立了5株永生化细胞株,分别为LCL1-5、LCL2-5、LCL3-5、LCL4-30、LCL5-30。

EB病毒转化的永生性人B淋巴母细胞中MTHFR基因的表达

为检测用 EB病毒转化建立的永生性人 B淋巴母细胞株中 N5 ,N1 0 -亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的表达及其 c DNA序列 ,用 EB病毒转化人外周血 B淋巴细胞 ,建立永生性细胞株后 ,从培养细胞中提取总 RNA,用 RT- PCR法扩增 MTHFR基因 c DNA的不同片段 ,进行 PAGE电泳分析和 c DNA序列测定。结果显示永生性人 B淋巴母细胞中有 MTHFR基因表达 ,其 c DNA序列与文献报道的人肝脏MTHFR基因 c

EBV转化的B淋巴母细胞系的建立及应用

EBV转化B淋巴细胞后 ,形成永生化的B淋巴母细胞系 (B LCL)。B LCL在体外能无限增殖 ,广泛应用于医学生物学研究领域。本文就EBV对B淋巴细胞的转化机制、建立B LCL应注意的问题以及B LCL在细胞与分子遗传学、免疫学。

EBV转化带状疱疹患者外周血B淋巴母细胞系的建立

目的体外建立带状疱疹患者永生化的淋巴母细胞系(LCL)。方法用EB病毒感染带状疱疹患者外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CpG 2006免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A抑制T淋巴细胞的活性。利用流式细胞术分析LCL膜表面分子CD抗原,利用PCR技术检测淋巴母细胞中EBNA1基因。结果 20例患者PBMC经EBV感染制备淋巴母细胞,13例转化成永生化B细胞来源的LCL,成功率为65%。转化后的LCL膜表面表达CD19和CD45,并存在EB病毒基因EBNA-1基因序列。结论利用EBV感染带状疱疹患者B淋巴细胞形成的LCL保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性,为体外研究水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染特异性细胞免疫和人源单克隆抗体制备打下基础。

富硒米提取液对EB病毒转化脐血B淋巴细胞及EBV早期抗原表达的影响

背景与目的:硒是人体必需的微量元素,具有抗氧化、抗衰老和抑制肿瘤细胞增殖的作用,为进一步探讨硒在肿瘤防治中的作用,我们培育出富含有机硒的大米,现研究富硒米对EB病毒激发脐血B淋巴细胞转化及对Raji细胞EB病毒早期抗原表达的影响。方法:①用富硒米及普通米提取液以1∶4、1∶8的浓度分别加到制备好的EB病毒液中,加入脐血单个核细胞进行淋巴母细胞转化培养实验,计算细胞转化抑制率;②Raji细胞经正丁酸及巴豆油联合诱导的同时加富硒米提取液共同培养,以间接荧光法,经伊文氏蓝复染观察计算EBV-EA抗原阳性率和抑制率。结果:含硒0.11μg/ml(1∶8稀释)的富硒米提取液显著抑制EB病毒对脐血B淋巴细胞的转化,抑制率为83.4%,明显高于普通米提取液的抑制率61.3%(P<0.05)。富硒米提取液对Raji细胞EB病毒早期抗原(earlyantigen,EA)表达有明显抑制作用,0.016、0.078、0.388μg/ml硒浓度组对EA抗原抑制率分别为2.85%、12.88%、20.75%。结论:富硒米提取液对EB病毒转化脐血B淋巴细胞和对Raji细胞EB病毒早期抗原均有明显的抑制作用。

乙型肝炎病毒感染者B淋巴母细胞系的建立

目的在体外建立HBV感染者永生化的B淋巴母细胞系(LCL),并鉴定其HLA-A基因亚型。方法利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞使之永生化,用环胞菌素A(Cys A)抑制血液中T淋巴细胞的活性;用PCR-SSP法检测血样本的HLA-A基因亚型。结果成功建立了HBV感染者的永生细胞株16株,其中急性乙肝4例,慢性乙肝10例,携带者2例。所有的细胞株冻存后复苏的成功率为100%。细胞株的HLA-A基因亚型包括1101、0201、0101、2403等。结论转化后的LCL保持了良好的稳定性,既可能作为人源单抗的来源,也可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。永生化细胞HLA-A基因亚型的鉴定有可能使其成为异体相应亚型体外特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。

阿司匹林诱导EB病毒转化的人B淋巴细胞凋亡

目的探讨阿司匹林诱导EB病毒转化的人B淋巴细胞凋亡及其机制。方法 EB病毒转化的人B淋巴细胞经一定浓度的阿司匹林处理后,首先通过MTT法分析细胞的增殖情况;然后用光学显微镜和电子显微镜、PI染色和流式细胞术分析以及琼脂糖凝胶电泳等方法对细胞凋亡进行评价;最后,通过免疫印记法检测凋亡相关蛋白、mTOR信号通路和PU.1-Bim信号通路蛋白表达情况。结果阿司匹林能抑制EB病毒转化的人B淋巴细胞增殖。形态学和超微结构观察发现,阿司匹林处理的细胞固缩变小、数目减少、细胞核畸形、染色质边缘化和细胞质空泡化。阿司匹林处理导致细胞膜通透性增加、细胞存活率明显下降和细胞DNA的弥散现象。免疫印迹分析显示,阿司匹林处理抑制了细胞的mTOR信号和转录因子PU.1的表达水平,激活了细胞凋亡相关蛋白caspase-3、PARP和Bim。结论阿司匹林可能通过抑制EB病毒转化的人B淋巴细胞增殖和诱导细胞凋亡表现一定的抗淋巴瘤效应,mTOR信号途径和PU.1-Bim轴可能参与了阿司匹林抗肿瘤作用机制。

含HTNV S基因重组痘苗病毒在HFRS患者B淋巴母细胞系中的表达

采用Ficoll密度梯度离心法(淋巴细胞分离液)分离肾综合征出血热(HFRS)患者外周血单个核细胞(PBMC),并用EB病毒(EBV)感染B淋巴细胞,建立永生化的B淋巴母细胞系(B-LCL)。然后,用含汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)S基因的重组痘苗病毒感染B-LCL,应用间接免疫荧光检测核衣壳蛋白的表达。结果表明,B淋巴细胞经EBV感染4周左右,可形成永生化B-LCL。成功转化后的B-LCL,体积增大,且增殖的淋巴细胞积聚成团。汉滩病毒S基因在B-LCL中能有效表达核衣壳蛋白。含S基因的重组痘苗病毒感染的B-LCL可用作HTNV核衣壳蛋白特异性CTL活性研究的靶细胞。

γδT细胞对EB病毒转化人类B淋巴细胞的免疫识别

目的 :研究γδT细胞对 EB病毒转化前后人类 B淋巴细胞识别的差异 ,寻找γδT细胞识别的肿瘤 /病毒感染诱生性抗原分子。 方法 :流式细胞仪检测 HSP6 0和 HSP70的表达 ,MTT法检测γδT细胞的杀伤作用 ,RT- PCR分析 MHC- 类链相关基因 A(MHC class chain- related gene A,M CA)的表达。结果 :HSP6 0和 HSP70分子以及 M CA基因在 EB病毒转化后细胞中高表达 ,γδT细胞对转化后细胞杀伤率明显增高 ,且其细胞毒作用能部分被抗 HSP6 0和 HSP70抗体所阻断。结论 :HSP6 0和 HSP70是 γδT细胞对 EB病毒转化后的 B淋巴细胞的识别靶点 ,但尚有其他抗原识别靶点 ,其中 M CA的可能性较大。

肾综合征出血热患者B淋巴母细胞系的建立方法及意义

目的 :探讨EB病毒 (EBV)转化B淋巴细胞的最佳方法 ,为进一步研究肾综合征出血热 (HFRS)患者的细胞免疫功能奠定基础。 方法 :采用环孢素A(CsA)法、微量全血法和冻存全血法三种方法建立B淋巴母细胞样细胞系 (B LCL) ,比较建立细胞系成功率和所用时间。 结果 :EBV成功转化后的B LCL ,其体积增大并永生化 ,进而增生的淋巴细胞积聚成团。CsA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为 73.3%、2 6 .7%和 4 6 .7%。 结论 :CsA法成功率高 ,建立细胞系所用时间短 ,是建立B LCL的最佳选择。

肾综合征出血热患者永生化B淋巴母细胞系的建立

目的 建立肾综合征出血热患者永生化的B淋巴母细胞系 ,为进一步研究汉滩病毒感染者的细胞免疫功能奠定基础。方法 自HFRS患者血液中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,再用EB病毒感染PBMC ,同时加入环胞素A(CysA)。 结果 2 0例血样标本经EBV感染 4周左右 ,形成了 15例永生化B淋巴母细胞系。成功转化后的B淋巴母细胞系 ,其体积增大 ,进而增殖的淋巴细胞积聚成团。结论 永生化的B淋巴母细胞系可传代培养。冻存复苏后细胞增殖活性并无改变。