人EC-SOD的克隆及高效表达

将编码人胞外超氧化物歧化酶 ( EC- SOD)成熟肽的 c DNA插入含 T7启动子的质粒p ET- 2 8a( + )中构建表达质粒 p ET- EC- SOD,表达菌株用 1 mmol/ L异丙基硫代 - β- D-半乳糖苷( IPTG)诱导表达 3h～ 5 h后 ,产生较多的重组人 EC- SOD,并形成包含体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS- PAGE)分析表明 ,表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白质的 2 6%以上。经纯化和复性后的EC- SOD比活为每毫克纯化酶蛋白 1 2 0 0 U。将 EC- SOD c DNA基因插入昆虫杆状病毒供体质粒p Fast Bac HTb中 ,重组杆状病毒 Bac HT- EC- SOD转染粉纹夜蛾 Tn- 5 Bl- 4细胞 ,经扩增后在细胞内进行表达。SDS- PAGE分析结果表明 ,粉纹夜蛾细胞中表达一相对分子质量约为 2 8ku的特异蛋白质带 ,Western blot分析表明 ,该特异条带即为 EC- SOD蛋白 ,连苯三酚自氧化法测得表达产物比活为每毫克细胞裂解物 2 60

EC-SOD包涵体的柱上复性、纯化及稳定性研究

利用His-tag与金属离子的特异结合作用,通过金属(Ni)亲和层析对EC-SOD包涵体进行柱上复性.考察蛋白上样量、尿素脱除速率和复性温度对复性效率的影响.利用Ni-sepharose和Heparin-sepharose亲和柱对重折叠后的蛋白进行纯化,并研究复性蛋白的稳定性.结果表明,利用Ni-sepharose亲和柱可以对EC-SOD进行复性,上样量越大,尿素脱除速率越快,复性效率越低;温度升高,复性效率增加.Ni-sepharose对复性后蛋白具有纯化作用,经Heparin-sepharose亲和柱纯化后蛋白比活明显提高.复性蛋白在10℃～50℃温度范围内活性稳定,pH低于5大于10时,其稳定性显著降低,在尿素和盐酸胍溶液中复性蛋白的稳定性较弱.

EC-SOD在大肠杆菌中的可溶性表达

目的 在大肠杆菌中表达可溶性EC -SOD。方法 将表达质粒EC -pet2 8a(+)转入宿主菌BL2 1 (DE3)plysS中进行表达,在低温下培养含表达质粒EC -pet2 8a(+)的宿主菌BL2 1 (DE3) ,通过SDS -PAGE电泳,观察其在超声上清中的表达。结果 EC -SOD在BL2 1 (DE3)plysS中表达,其量比在BL2 1 (DE3)降低约2 0 %,上清中有明显表达;在2 0℃和1 5℃培养时,EC -SOD在BL2 1 (DE3)的超声上清中有表达。结论 EC -SOD在BL2 1 (DE3)plysS中或在BL2 1 (DE3)中低温培养,均可实现部分上清中的表达。

NFκBIA HaeⅢ、EC-SOD基因多态性和饮酒与溃疡性结肠炎的相关性

目的探讨核转录因子-κB抑制因子HaeⅢ(NFκBIA HaeⅢ)、细胞外超氧化物岐化酶(EC-SOD)基因多态性和饮酒与溃疡性结肠炎(UC)发病之间的关系。方法采用病例-对照研究的方法,以400例UC患者及400例健康对照者的外周血白细胞为样本,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术分析了NFκBIA HaeⅢ和EC-SOD基因多态性。结果 NFκBIA HaeⅢ(Non-A/A)基因型和EC-SOD(C/G)基因型频率分布分别为39.50%、71.50%(病例组)和21.25%、43.00%(对照组),二者经χ2检验差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。NFκBIAHaeⅢ(Non-A/A)患UC的风险显著增加(OR=2.419 5,95%CI=1.827 1～4.065 4)。EC-SOD(C/G)基因型者患UC的风险也显著增加(OR=3.325 6,95%CI=1.908 5～4.538 7)。基因突变的协同分析发现,NFκBIA HaeⅢ(Non-A/A)/EC-SOD(C/G)基因型者在UC组和对照组中的分布频率分别为32.50%和6.25%,二者经χ2检验有显著性差异(P<0.01)。NFκBIA HaeⅢ(Non-A/A)/EC-SOD(C/G)基因型者患UC的风险显著增加(OR=10.158 1,95%CI=4.192 4～12.309 4)。病例组的饮酒率显著高于对照组(OR=2.583 7,95%CI=1.408 1～4.932 6,P<0.01),NFκBIA HaeⅢ(Non-A/A)/EC-SOD(C/G)基因型与饮酒有协同作用(OR=35.209 9,95%CI=19.975 1～62.592 2)。结论 NFκBIA HaeⅢ(Non-A/A)/EC-SOD(C/G)基因型和饮酒是UC的易患因素,三者在UC发生中起协同作用。

人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

利用基因工程技术构建表达载体并电转化至毕赤酵母中,成功实现人源EC-SOD在毕赤酵母X33中的表达.重组蛋白经盐酸羟胺法测得25 mL摇瓶发酵液上清酶活为508 U·mg^(-1),5 L发酵液上清酶活为909U·mg^(-1).发酵液上清用硫酸铵沉降后,使用DEAE弱阴离子交换树脂初步分离纯化出较纯的EC-SOD,测得比活为1 700 U·mg^(-1),并进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)活性定性染色.结果表明,毕赤酵母成功胞外表达具有一定活性的SOD蛋白.

重组人EC-SOD包涵体的稀释复性及重折叠后蛋白的纯化

目的确定重组人ECSOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法。方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的基本条件。采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparinsepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异。结果最佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5molL,精氨酸浓度大于0.3molL,GSH∶GSSG=4∶1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低。IMAC和Heparinsepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparinsepharose纯化效率较高。结论确定了重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的最佳条件及复性后蛋白纯化的方法。

人EC-SOD在大肠杆菌中表达的发酵条件研究

对含人EC-SOD重组质粒的工程菌进行诱导表达形成包涵体。通过SDS-PAGE电泳分析,考察了诱导时间和诱导剂种类、浓度对EC-SOD表达量的影响。同时考察了细胞培养温度对产物表达形式的影响,并对菌体密度不同时诱导表达的结果进行了比较。

人EC-SOD基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建携带EC-SOD基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体,并观察其在人脐带间充质干细胞(hu MSCs)细胞中的表达。方法:从人外周血中提取总RNA,逆转率制备c DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)中获取EC-SOD基因,其与真核表达载体p CS2+经Cla I/Eco RI双酶切后;经T4 DNA连接酶连接,获得重组质粒p CS2+-EC-SOD,用菌液PCR、Cla I/Eco RI双酶切及测序鉴定正确后,将其与经PCR获取的EGFP基因用Eco RI/xba I双酶切;经T4 DNA连接酶连接,获得p CS2+-EC-SOD-EGFP重组质粒,用菌落PCR、Eco RI/xba I双酶切及测序鉴定。用纳米试剂法转染hu MSCs细胞,用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达。结果:成功获取了EC-SOD基因和EGFP基因,重组质粒p CS2+-ECSOD-EGFP经菌落PCR和双酶切均得到大小一致的目的条带,经测序鉴定该序列与Gen Bank中人EC-SOD基因、EGFP基因序列的同源性达100%,基因插入方向正确;重组质粒转染hu MSCs细胞后可见EGFP增强绿色荧光蛋白表达。结论:成功构建了EC-SOD的真核表达重组质粒p CS2+-EC-SOD-EGFP,且能在hu MSCs细胞中表达。

腺相关病毒转导EC-SOD对耳蜗药物性损害的保护作用

目的探讨腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为载体,介导分泌型超氧化物歧化酶(extracel-lular superoxide dismutase,EC-SOD)基因,转染耳蜗细胞后对卡那霉素致大鼠耳蜗损害的保护作用。方法构建AAV8血清型载体,携载绿荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)或EC-SOD基因,体外感染细胞,蛋白电泳检测EC-SOD的表达;将AAV8-EGFP和AAV8-EC-SOD分别微注射到卡那霉素耳聋模型大鼠耳蜗内,检测听性脑干反应阈值变化,生化法检测耳蜗外淋巴液EC-SOD酶活性,免疫组织化学检测EC-SOD蛋白在耳蜗细胞内的表达,耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞染色检测细胞存活的数量。结果AAV8转导的绿荧光蛋白可在耳蜗内毛细胞、螺旋韧带细胞、内沟细胞等多种细胞内表达。体外蛋白电泳检测EC-SOD在细胞培养液中存在单体、二聚体、四聚体等;在AAV8-EC-SOD组注射载体的耳蜗外淋巴液中EC-SOD酶活性明显高于AAV8-EGFP组,转导的EC-SOD在耳蜗内的表达分布与绿荧光蛋白的表达相似。在卡那霉素耳聋模型鼠中,AAV8-EC-SOD组的ABR反应阈值变化比AAV8-EGFP组明显小,AAV8-EC-SOD组的耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞比AAV8-EGFP组的存活多,差异有显著统计学意义。结论AAV8型载体可转染耳蜗内多种细胞,AAV8型转导的EC-SOD可以拮抗氨基糖甙类抗生素对耳蜗的损害。

大孔吸附树脂在EC-SOD纯化中的作用

目的本文主要论述了大孔吸附树脂在EC-SOD的分离与纯化中所起的作用。该研究在大孔吸附树脂的应用方面有很大的开创性意义。方法研究了非极性大孔吸附树脂在蛋白纯化中去除杂蛋白及DNA碎片、色素等成份的效果。结果研究结果表明在33℃,上样量在30%总吸附量,上样速度在20mL.min-1、pH值为7时有很好的吸附解吸附效果,蛋白回收率90%以上。结论非极性大孔吸附树脂对于粗蛋白的纯化去除杂质效果显著,快速方便,成本低,更适于产业化。

添加于EC-SOD中的肝素提高SOD效果

经小鼠实验证明重组人 EC-SOD(Extracellular SOD)有抑制炎症的效果.藤沢药品开发研究所大柳善彦在第6次 Climical Confenence on Free Radical 上发表了这项结果.这种重组人 EC-SOD 的基因是瑞典 Umea 大学克隆化的.通过瑞典 Astra 公司。

胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)抗辐射作用的研究进展

电磁辐射、电离辐射、光辐射等辐射导致的组织器官损伤过程中常伴有活性氧(ROS)的激活和DNA损伤,而超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内广泛存在的一种抗氧化金属酶,在氧化-抗氧化平衡调控中发挥着重要的作用,并且参与了众多疾病的发生与发展,其中胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)主要分布于细胞外基质中。大量研究表明EC-SOD在多种组织器官的辐射损伤中发挥着抗辐射的作用,其主要通过降低ROS水平、抗血管生成,抗趋化和抗炎等方式防止细胞和组织的进一步损伤。因此,本文将对EC-SOD及其模拟物或类似物在辐射防护中的保护作用及其机制进行综述,为EC-SOD应用于辐射防护提供理论参考。

EC-SOD和GSTM1基因多态性及吸烟与口腔癌风险关系研究

目的探讨细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)和谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)基因多态性及吸烟与口腔癌风险之间的关系。方法利用病例-对照分子流行病学研究方法和聚合酶链反应技术对600例口腔癌患者和600健康正常对照者DNA进行EC-SOD和GSTM1基因分型,logistic回归方法估计基因、基因与吸烟的交互作用对口腔癌发病的危险度。结果 EC-SOD各基因型口腔癌病例组与对照组间的频率分别为在C/C型61.17%、78.50%,C/G型38.33%、21.50%,分布差异有显著性(P<0.01),EC-SOD(C/G)基因型使口腔癌的发生的危险性增加(OR=2.27,95%CI 1.73-4.02)。口腔癌组GSTM1(-)基因型频率(69.17%)显著高于对照组(44.17%)(P<0.01),GSTM1(-)基因型增加了口腔癌发生的危险性(OR=2.84,95%CI 1.95-4.47).基因突变的协同分析发现EC-SOD(C/G)/GSTM1(-)在口腔癌组和对照组中的分布频率分别为30.50%和6.67%,分布有显著性差异(P<0.01)。EC-SOD(C/G)/GSTM1(-)患口腔癌的风险性明显高于EC-SOD(C/C)/GSTM1(+)基因型者(OR=8.16,95%CI 3.73-12.91)。病例组的吸烟率显著高于对照组的吸烟率(P<0.01),吸烟显著提高口腔癌发生的危险性(OR=2.66,95%CI 1.45-4.36)。EC-SOD(C/G)及GSTM1(-)与吸烟有协同作用(OR=25.11,95%CI 12.37-36.62)。结论 EC-SOD(C/G)和GSTM1(-)是口腔癌的易患因素,二者对口腔癌的发生有协同作用,吸烟与口腔癌的易感性也有关,EC-SOD(C/G)和GSTM1(-)与吸烟在口腔癌的发生上具有相互促进作用。

凋亡素融合蛋白在HeLa细胞中的转导及体外活性分析

研究胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)的肝素结合域(HBD)在HeLa细胞中的转导活性,并证实HBD具有运载药物蛋白(凋亡素)进入细胞并诱导肿瘤细胞凋亡的能力。通过克隆表达的HBD-EGFP融合蛋白经Ni2+-NTA纯化后,观察其转导活性;并利用HBD-凋亡素融合蛋白表达纯化后,用噻唑蓝(MTT法)检测肿瘤细胞的凋亡。结果表明:用荧光显微镜可观察到HeLa细胞内有绿色荧光;MTT法检测表明凋亡素融合蛋白能诱导HeLa细胞的凋亡;HBD具有转导活性,能携带药物蛋白(凋亡素)进入细胞并能诱导HeLa细胞的凋亡。

SOD口腔膜剂的研制及对口腔粘膜溃疡的治疗作用

考察超氧化物歧化酶(SOD)口腔贴膜制备过程中温度和保温时间对SOD活性的影响及不同厚度药膜药物释放度的差异测定药膜中SOD的活性及其回收率、体外溶出、皮肤刺激性及药膜中SOD稳定性;并进行药膜重量差异检查和卫生学检查;建立制备动物口腔粘膜溃疡模型,从溃面直径和愈合期两个方面考察药物的疗效。结果表明65°C下保温2h,SOD基本保持原有的活性;药膜厚度增加释药时间会延长;Cu,Zn-SOD和EC-SOD药膜的药物含量分别为(504.69±27.31)U/cm2和(489.0±22.4)U/cm2,并在15min内药物全部溶出;无皮肤刺激性,4°C下保存一个月药膜中药物含量稳定;与空白组比较,SOD药膜能显著减小溃面直径,缩短溃疡愈合期。

重组人ECSOD包涵体的复性

目的 将E.coli中表达的人胞外超氧化物歧化酶(hEC SOD)包涵体进行复性。方法 分离包涵体,用8mol L尿素溶解后进行透析复性。结果 包涵体蛋白可以部分复性,比活达到900U mg protein。结论 透析复性法可以复性EC SOD包涵体。

低温胁迫对韭菜膜透性及保护酶活性的影响

以汉中雪韭(较耐寒)、紫根(中度耐寒)、791(不耐寒)3个韭菜品种为试材,研究了5/0℃和0℃低温胁迫下其叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、相对电导率(EC)的动态变化。结果表明,在5/0℃和0℃低温胁迫下,三者POD和SOD活性均先上升后下降,CAT活性下降,MDA和EC升高。

卷烟烟气总粒相物诱导A549细胞的氧化应激研究

为研究卷烟烟气总粒相物(TPM)对人肺腺癌细胞(A549)的氧化损伤,捕集3R4F参比卷烟主流烟气的TPM,对A549细胞进行染毒,采用中性红细胞毒性法测试TPM与A549细胞存活率的剂量-效应关系,检测了细胞内谷胱甘肽(GSH)和细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)两种氧化应激指标。结果表明:1TPM与A549细胞存活率之间存在良好的剂量-效应关系。2细胞发生氧化应激时,细胞内还原态谷胱甘肽和氧化态谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)相对于阴性对照组有显著降低,且不随染毒时间的增加而变化;EC-SOD在染毒4 h后没有显著增加,但24 h后有显著增加。

细胞外超氧化物歧化酶单倍域与急性肺损伤及其病死率密切相关

细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）是一种有效的抗氧化剂，在控制氧化剂介导的应激反应和炎症中起重要作用。肺组织中可发现高水平的EC-SOD。然而，EC-SOD单倍域与急性肺损伤及其病死率之间的关系还不明了。美国科罗拉多大学的Arcaroli JJ等发现，在感染所致的急性肺损伤患者和内毒素血症所诱导的急性肺损伤转基因动物模型中，