全反式维甲酸联合LY294002对食管癌EC1细胞增殖、迁移及PI3K、MMP-2表达的影响

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)、磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)抑制剂LY294002单独或联合作用对食管癌EC1细胞增殖、迁移及PI3K和MMP-2表达的影响。方法:将常规培养的EC1细胞随机分为ATRA组、LY294002组、ATRA+LY294002组和对照组4组,采用CCK-8检测各组细胞的增殖情况,通过划痕实验测定各组细胞的迁移能力,采用RT-PCR和Western blot方法检测各组细胞中PI3K及MMP-3 mRNA和蛋白的表达情况。结果:作用24、48和72 h后,ATRA+LY294002组的细胞增殖抑制率均高于其他2组(P<0.05);作用24 h后,ATRA+LY294002组细胞迁移能力均低于其他3组(P<0.05);作用48 h后,ATRA+LY294002组细胞PI3K及MMP-2 mRNA和蛋白的表达量均低于其他3组(P<0.05)。结论:ATRA联合LY294002可协同抑制EC1细胞的增殖、迁移和PI3K、MMP-2的表达,进而可能协同抑制肿瘤血管生成。

顺铂对TRAIL诱导EC1细胞凋亡的增敏效应

目的:观察顺铂(cDDP)对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导EC1细胞凋亡的增敏效应。方法:MTT法检测单用TRAIL(10、50、100、500和1000μg/L)或cDDP(1.0、2.0、4.0、10.0和20.0mg/L)分别作用24、48和72h对EC1细胞增殖的影响。流式细胞术检测100μg/LTRAIL和10.0mg/LcDDP单用或联用48h对EC1细胞凋亡和细胞周期的影响,并设空白对照组。结果:单用TRAIL作用24、48和72h对EC1细胞增殖影响不明显(P>0.05),单用cDDP对EC1细胞增殖有抑制作用(P<0.05)。单用TRAIL对EC1细胞凋亡率无影响(FTRAIL=5.836,P=0.250),而单用cDDP可提高EC1细胞凋亡率(FcDDP=20.763,P=0.041),二者联合有交互作用(F交互=57.422,P<0.001)。单用TRAIL和cDDP对EC1细胞周期无影响,二者联用后G0/G1和S期细胞比例下降,G2/M细胞比例上升(P均<0.001)。结论:cDDP可增加EC1细胞对TRAIL的敏感性,二者联用可诱导EC1细胞凋亡,并诱导其在G/M期阻滞。

端粒酶抑制因子X1过表达对人食管癌EC1细胞增殖及凋亡的影响

目的探究端粒酶抑制因子X1(PinX1)对人食管癌EC1细胞增殖及凋亡的影响。方法体外培养人食管癌细胞系EC1细胞株,并将其分为空白对照(NG)组(空白对照细胞)、pcDNA组(转染阴性对照质粒)、pcDNA-PinX1组(转染PinX1过表达质粒)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)组(加入信号通路抑制剂)。采用实时荧光定量PCR法检测各组PinX1 mRNA的表达水平。分别采用CCK-8法和流式细胞术检测各组细胞的增殖、凋亡情况。采用荧光探针法检测各组活性氧簇(ROS)水平。采用蛋白质印迹法检测各组腺苷酸激活蛋白激酶/信号转导与转录激活因子3(AMPK/STAT3)信号通路相关蛋白的表达水平。结果经成功转染细胞后,与NG组、pcDNA组比较,pcDNA-PinX1组细胞的增殖抑制率、凋亡率、ROS水平、p-AMPK/AMPK均升高,而p-STAT3/STAT3均降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与pcDNA-PinX1组比较,NAC组细胞的增殖抑制率、凋亡率、ROS水平、p-AMPK/AMPK均降低,p-STAT3/STAT3升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论PinX1过表达可抑制人食管癌EC1细胞增殖并诱导其凋亡,可能通过促进ROS/AMPK/STAT3信号通路活化来实现。

曲古菌素A对食管癌细胞系EC1细胞凋亡的影响

目的:探讨曲古菌素A(TSA)对食管癌EC1细胞凋亡的影响。方法:用DMSO(对照组)和0.3、0.5及1.0μmol/L的TSA处理EC1细胞24 h,用Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测4组细胞的凋亡率,West-ern Blot检测4组细胞中Bax及Bcl-2表达的变化。结果:对照组、0.3、0.5及1.0μmol/L TSA组作用24 h后,EC1细胞凋亡率分别为(2.18±0.37)%、(2.96±0.34)%、(7.41±1.01)%和(14.03±1.23)%,Bax蛋白表达水平分别为(0.42±0.23)、(0.45±0.11)、(1.16±0.28)和(1.89±0.30),Bcl-2蛋白表达水平分别为(1.15±0.14)、(1.11±0.15)、(0.59±0.06)和(0.40±0.07),4组间3指标差异均有统计学意义(F=211.96,25.12和33.68,P均<0.001),随TSA作用浓度的增加,EC1细胞凋亡率、Bax蛋白表达均增加,Bcl-2表达减少。结论:一定剂量的TSA可以诱导EC1细胞凋亡,凋亡的发生可能与Bax表达增加和Bcl-2表达减少有关。

地塞米松和1,25-(OH)_2D_3对EC1细胞增殖和细胞周期的影响

目的:观察地塞米松(DEX)和1,25-(OH)2D3及2药联用对食管鳞状细胞癌EC1细胞增殖及周期的影响。方法:分别用10-7mol/LDEX与10-7mol/L1,25-(OH)2D3以及同种浓度2药联合处理EC1细胞48、72和96h,并设溶剂对照组。采用MTT法检测细胞增殖情况及流式细胞仪检测细胞周期变化。结果:1,25-(OH)2D3单独应用具有抑制EC1细胞增殖的作用(F1,25-(OH)2D3=51.185,P<0.001);DEX单独应用具有阻滞细胞周期的作用(FDEX=8.170,P=0.009)。DEX、1,25-(OH)2D3及时间3种因素两两间均存在交互作用(细胞增殖抑制:F1,25-(OH)2D3×DEX=11.017,P=0.003;F1,25-(OH)2D3×时间=3.668,P=0.041;FDEX×时间=7.887,P=0.002。G0/G1期细胞比率:F1,25-(OH)2D3×DEX=12.381,P=0.002;F1,25-(OH)2D3×时间=6.583,P=0.005;FDEX×时间=5.096,P=0.014),且两药间提示存在拮抗作用。未发现3因素之间存在交互作用(细胞增殖抑制:F1,25-(OH)2D3×DEX×时间=0.512,P=0.606。G0/G1期细胞比率:F1,25-(OH)2D3×DEX×时间=0.410,P=0.668)。结论:DEX和1,25-(OH)2D3单独及联合使用能对EC1细胞增殖起抑制作用,且使EC1细胞周期阻滞在G0/G1期。

雷帕霉素对食管癌EC1细胞mTOR表达及细胞生长与凋亡的影响

目的:探讨雷帕霉素对人食管癌EC1细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达及细胞生长、凋亡的影响。方法:采用低、中、高浓度的雷帕霉素(100、150、200nmol/L)分别作用于EC1细胞24、48、72h,同时设溶剂对照组和空白对照组,用免疫细胞化学及原位杂交法检测EC1细胞中mTOR蛋白与mRNA的表达,MTT法检测EC1细胞的增殖情况,TUNEL法检测各组作用24h后细胞凋亡情况。结果:雷帕霉素作用24、48与72h,5组细胞mTOR蛋白与mRNA的表达差异均有统计学意义(mTOR蛋白:F=29.273、34.328、41.571,P均<0.001;mTORmRNA:F=34.969、53.614、36.943,P均<0.001),细胞生长抑制率差异亦有统计学意义(F=566.732、51.768和186.022,P均<0.001);雷帕霉素低、中、高浓度组EC1细胞mTOR蛋白与mRNA的表达均低于各对照组,且其表达随雷帕霉素浓度的增加及作用时间的延长而减弱(P<0.05)。雷帕霉素低、中、高浓度组细胞生长抑制率均高于各对照组,且随雷帕霉素浓度的增加和作用时间的延长而升高(P<0.05)。作用24h,5组细胞凋亡指数(AI)差异有统计学意义(F=524.563,P<0.001),雷帕霉素低、中、高浓度组AI均高于各对照组,且随雷帕霉素浓度的增加而增高(P<0.05)。结论:雷帕霉素可能通过抑制EC1细胞mTOR蛋白与mRNA的表达从而抑制EC1细胞的增殖,促进细胞凋亡。

转录因子8在食管癌细胞EC1的表达及其对EC1细胞迁移侵袭的影响

目的:研究食管癌细胞EC1中转录因子8(transcription factor 8,TCF8)的表达对EC1细胞迁移侵袭的影响。方法:通过共聚焦显微镜观察EC1细胞中TCF8的表达;吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)作用于EC1细胞24 h后,Western blot法检测NF-κBp65、TCF8和E-cadherin蛋白表达变化,划痕损伤和transwell实验检测对细胞转移和侵袭的影响。结果:TCF8表达于EC1细胞核,PDTC可以导致EC1细胞中NF-κBp65、TCF8表达降低,而E-cadherin表达增高;PDTC组细胞迁移距离和穿过的细胞数明显低于对照组。结论:食管癌细胞EC1中表达TCF8,下调TCF8可上调E-cadherin,抑制EC1细胞的迁移侵袭,为阐明食管癌侵袭转移的分子机制提供理论依据,为临床治疗提供分子靶点。

β-胡萝卜素对食管鳞癌EC1细胞内活性氧和细胞凋亡的影响

目的:探讨β-胡萝卜素对食管鳞癌EC1细胞内活性氧和细胞凋亡的影响。方法:分别用不同质量浓度的β-胡萝卜素(30、50、80μmo L/L)处理食管鳞癌EC1细胞48 h后,采用化学荧光法检测EC1细胞内活性氧(ROS)含量变化,通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变检测线粒体膜电位(MMP)变化,ELISA法检测胞内细胞色素C(Cyt-C)含量的变化,Western blot检测Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达,流式细胞术检测不同质量浓度的β-胡萝卜素对EC1细胞凋亡的影响。结果:β-胡萝卜素处理能够提高EC1细胞内ROS含量,引起MMP下降,促进Cyt-C的释放,上调Bax和Caspase-3蛋白表达,并下调Bcl-2蛋白表达;同时,β-胡萝卜素作用能提高EC1细胞凋亡率。结论:β-胡萝卜素能够通过上调细胞内ROS的水平,降低MMP,进一步促进食管鳞癌细胞凋亡。

Smac过表达对食管鳞癌细胞Warburg效应和细胞凋亡的影响

目的:探究Smac过表达对食管鳞癌细胞Warburg效应和细胞凋亡的影响。方法:以含Smac过表达载体的慢病毒感染食管鳞癌细胞EC1和Eca109(Smac过表达组),以感染含空载体的慢病毒为阴性对照,以未感染细胞为空白对照。采用Western blot法检测3组细胞Smac蛋白的表达情况。用过氧化氢刺激Smac过表达组和阴性对照组细胞,利用线粒体膜电位检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞线粒体膜电位和细胞凋亡情况,并用Western blot法检测细胞中凋亡信号通路相关蛋白[细胞色素C(Cyt-C)、Bcl-2、Caspase-3前体]以及Warburg效应关键蛋白[己糖激酶Ⅱ(HK2)和乳酸脱氢酶(LDH)]的表达。结果:EC1和Eca109 Smac过表达组Smac蛋白表达水平升高,提示成功构建了Smac过表达细胞株。经过氧化氢刺激后,与阴性对照组相比,Smac过表达组HK2和LDH表达水平下降,细胞线粒体膜电位降低,细胞凋亡率升高,Cyt-C的表达水平升高,Bcl-2和Caspase-3前体蛋白的表达水平下降(P<0.05)。结论:氧化应激刺激下,Smac过表达可抑制食管鳞癌细胞的Warburg效应,促进食管鳞癌细胞凋亡。

雷帕霉素靶蛋白RNA干扰联合雷帕霉素对人食管癌移植瘤生长和移植瘤组织中雷帕霉素蛋白基因表达的影响

目的:探讨RNA干扰技术联合雷帕霉素对人食管癌裸鼠移植瘤生长和移植瘤组织中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因表达的影响。方法:①构建裸鼠食管癌EC1细胞移植瘤模型,待肿瘤长出1周后,将荷瘤小鼠随机分为雷帕霉素治疗组[(腹腔注射雷帕霉素,50μg/(kg.次)]、mTOR小分子干扰RNA(siRNA)治疗组[腹腔注射mTORsiRNA,3μg/次]和联合治疗组(先腹腔注射mTORsiRNA,第2天腹腔注射雷帕霉素),另设空白对照组(腹腔注射PBS代替药物)和顺铂治疗组[腹腔注射常规化疗药顺铂,1mg/(kg.次)];每组各5只。连续治疗2周,治疗结束取瘤组织,分析治疗前后移植瘤体积的变化。②采用免疫组化及原位杂交技术观察各组瘤组织中mTOR蛋白及mRNA的表达。结果:①单用雷帕霉素(F=185.00,P<0.001)或mTORsiRNA(F=199.01,P<0.001)均能降低裸鼠移植瘤体积;雷帕霉素和mTORsiRNA有交互作用(F=30.30,P<0.001),2者联合应用后,裸鼠移植瘤体积有更大幅度的下降。顺铂治疗后,裸鼠移植瘤体积与联合治疗的效果差异无统计学意义(t=0.426,P=0.682)。②单用雷帕霉素(F=395.76,F=550.04,P均<0.001)或mTORsiRNA(F=367.58,F=573.39,P均<0.001)均能降低裸鼠移植瘤组织中mTOR蛋白及mRNA的表达;雷帕霉素和mTORsiRNA有交互作用(F=11.68,P=0.004;F=10.23,P=0.006),2者联合应用后,裸鼠移植瘤组织中mTOR蛋白及mRNA的表达有更大幅度的下降。顺铂治疗后,裸鼠移植瘤组织中mTOR蛋白(7.15±0.56)及mRNA(6.88±0.59)的表达与联合治疗的效果差异无统计学意义(t=0.622,P=0.551;t=0.572,P=0.583)。结论:应用RNA干扰技术沉默mTOR基因及应用雷帕霉素治疗均可有效抑制肿瘤的生长,下调裸鼠食管癌移植瘤组织中mTOR蛋白及mRNA的表达,且2者联合效果最佳。

β-胡萝卜素对食管癌细胞凋亡与Cav-1表达的影响

目的:观察β-胡萝卜素对食管癌细胞凋亡的影响,并分析食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性与小窝蛋白-1(Cav-1)表达的关系。方法:采用Western blot法检测正常食管上皮细胞株Het-1A及食管癌细胞(TE1、EC1和Eca109)中Cav-1蛋白的表达;CCK-8法检测不同浓度(0、1、5、10、20、30、50μmol/L)β-胡萝卜素处理食管癌细胞12、24、36、48、60、72 h后,对食管癌细胞增殖抑制的影响,筛选出β-胡萝卜素的最佳处理时间及浓度;在筛选条件下处理食管癌细胞,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;qRT-PCR检测Cav-1 mRNA表达水平的变化;Western blot检测Cav-1蛋白表达水平的变化。结果:Cav-1蛋白在食管癌细胞中呈过表达(TE1>Eca109>EC1),而Het-1A细胞中无Cav-1表达。β-胡萝卜素对正常食管上皮细胞的增殖无抑制作用,而对食管癌细胞(TE1、EC1和Eca109)的增殖抑制作用具有时间和剂量依赖性,且食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性与Cav-1的表达有关。分别采用30、50、50μmol/Lβ-胡萝卜素处理48 h后,TE1、Eca109和EC1细胞凋亡率显著提高(P<0.05),Cav-1mRNA和蛋白质表达水平均明显下降。结论:β-胡萝卜素能够有效促进食管癌细胞凋亡,而对正常食管上皮细胞无毒性作用,且食管癌细胞对β-胡萝卜素的敏感性可能受到Cav-1的调节。

重组PAC1-EC1(N)对表达不同PAC1变体的细胞系细胞活性的影响

垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)特异受体PAC1(normal型)N端胞外域[简称PAC1-EC1(N)]具有调控PAC1活性的作用。为研究PAC1-EC1(N)对表达不同PAC1变体的细胞系活性的影响,利用基因工程技术获得C端带有6个his纯化标签的重组PAC1-EC1(N)。质谱检测、SDS-PAGE电泳和Western blot检测结果均显示成功表达和纯化目的蛋白PAC1-EC1(N)。Western blot检测确定兔眼角膜基质细胞、人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人前列腺癌细胞22RV1中分别表达一个或多个分子量不同的PAC1变体。重组PAC1-EC1(N)作用3株细胞,MTT方法检测细胞活性,结果显示:PAC1-EC1(N)有效促进只表达一个小分子PAC1变体的兔眼角膜基质细胞的增殖;但显著抑制只表达一个大分子PAC1变体的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的活性。对于表达3种大小不一的PAC1变体的人前列腺癌细胞22RV1,PAC1-EC1(N)对细胞的活性具有复杂的调控。显示PAC1-EC1(N)对表达PAC1变体数量不同,类型不同的细胞具有不同的生物活性的作用,提示了PAC1变体可能具有较复杂的自我调控机制。