拟南芥ECT7蛋白的相互作用蛋白及翻译后修饰的鉴定

Evolutionarily conserved C-terminal region (ECT)蛋白是植物中的一类RNA结合蛋白,负责识别RNA的6-甲基腺嘌呤(N6-methyl-adenosine, m6A)修饰。m6A结合蛋白被报道在动物体的生命活动及发育过程中起重要调控作用,而植物中ECT家族仅有少量报道且具体功能及工作机制尚不清楚,亟待研究。本文利用基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法鉴定了ECT7蛋白的相互作用蛋白及翻译后修饰,共鉴定到45个ECT7的相互作用蛋白,其中包括其自身和同源蛋白ECT8 (evolutionarily conserved C-terminal region8)在内的5个RNA结合蛋白,并利用酵母双杂交实验对ECT家族蛋白之间进行了互作验证,发现ECT7可与多个ECT家族成员相互作用。不仅如此,还鉴定到ECT7蛋白有4个氧连-氮乙酰葡萄糖胺(O-linkedβ-N-acetyl glucosamine, O-GlcNAc)修饰位点和4个磷酸化修饰位点。研究结果对于进一步研究ECT7蛋白的功能及其识别m6A修饰的分子机制提供了理论依据。

ECT 6和ECT 7调控拟南芥开花时间的研究

m^(6)A修饰是mRNA上含量最丰富的一种修饰,调控mRNA的命运决定。YT521-B同源性(YTH)结构域蛋白是一类典型的m^(6)A“阅读器”,能识别并结合m^(6)A,完成基因的转录后调控。为了探究拟南芥YTH结构域蛋白ECT6和ECT7的功能及其分子机制,该研究对ect 6、ect 7和ect 6 ect 7双突变体进行基因型和半定量PCR鉴定及开花表型观察,通过细胞学观察分析ECT6和ECT7的亚细胞定位,并采用qRT-PCR检测开花关键基因的表达量。结果显示:(1)ECT 6基因组包含5个外显子和4个内含子,ect 6突变体分别插入在ECT 6基因的第3和第5外显子;ECT 7基因组包含6个外显子和5个内含子,ect 7突变体分别插入在ECT 7基因的第4和第6外显子。(2)突变体ect 6和ect 7均为完全敲除的功能缺失突变体,在长日照下二者均表现出开花提前和叶片数减少。(3)在长日照和短日照下ect6 ect7双突变体均表现出开花提前和叶片数减少。(4)开花抑制基因FLC和成花素基因FT是关键的开花调控因子,qRT-PCR分析结果显示,在ect 6 ect 7双突变体中,FLC的表达水平降低,FT的表达水平升高,且春化通路基因VIN 3、VRN 2、VRN 5和自主通路基因FVE的表达水平也显著升高。(5)ECT6和ECT7均定位于细胞核和细胞质中。

宫颈癌细胞株HeLa与正常宫颈细胞株Ect1/E6E7的微小RNA表达谱的差异

目的探讨宫颈癌细胞株HeLa与正常宫颈细胞株Ect1/E6E7中微小RNA(miRNA)分子表达谱的差异。方法选取HeLa细胞和Ect1/E6E7细胞各3个样本分别作为实验组和对照组,采用miRNA芯片筛选两者之间差异表达的miRNA,样品间表达变化标准以上/下调4倍作为阈值范围,并运用miRWalk软件预测差异表达miRNA可能调控的靶基因,并对这些靶基因进行信号通路的富集分析。结果在HeLa细胞中,上调超过4倍差异表达miRNA分子7个,下调超过4倍差异表达miRNA分子16个(P<0.01)。生物信息学分析发现hsa-miR-126-3p的靶基因在肿瘤通路、凋亡通路以及Wnt信号通路上出现聚集;而hsa-miR-25-5p的靶基因肿瘤通路和钙离子信号通路出现聚集;且hsa-miR-205-5p靶基因在TGF-β信号通路和EGFR信号通路出现聚集。结论宫颈癌细胞HeLa与正常宫颈细胞Ect1/E6E7之间存在差异表达miRNA分子,他们可能参与宫颈癌的发生发展机制。

派特灵对Ect1/E6E7细胞增殖迁移能力及Wnt/β-catenin通路的影响

目的:研究派特灵对Ect1/E6E7细胞增殖迁移能力及Wnt/β-catenin通路的影响。方法:以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞,将细胞分为对照组和派特灵组(3.906、2.604、1.953、1.563、1.302、1.116、0.977g/L),加药干预24h,镜下观察细胞形态变化,并采用MTT法检测细胞活力,计算派特灵对Ect1/E6E7细胞的半数抑制浓度(IC50);将Ect1/E6E7细胞分为对照组,顺铂组(0.01g/L),抑制剂组,派特灵高、中、低浓度组(2.974、1.487、0.991g/L),分别用CCK-8、划痕、Transwell方法检测派特灵对Ect1/E6E7细胞增殖迁移能力的影响;以及用免疫组化、Western Blotting方法检测各组细胞Wnt4、β-catenin蛋白的表达。结果:对照组细胞呈扁平多边形,顺铂组、派特灵各浓度组细胞皱缩、体积变小、数量减少,以派特灵高浓度组最明显;MTT实验显示,派特灵对Ect1/E6E7细胞增殖有明显抑制作用,IC50为2.974g/L;CCK-8法结果示顺铂组和派特灵高浓度组对Ect1/E6E7细胞增殖有较强抑制作用;划痕实验示派特灵高浓度组、顺铂组药物干预12h后,划痕面积均显著高于对照组(P<0.01,P<0.05),派特灵高浓度组划痕面积高于派特灵低浓度组(P<0.05);药物干预24h后,派特灵高浓度组、顺铂组划痕面积显著高于对照组和派特灵中、低浓度组(P<0.01);Transwell迁移实验示顺铂组、派特灵各浓度组细胞迁移数量显著低于对照组(P<0.01),顺铂组、派特灵高浓度组细胞迁移数量显著低于派特灵中、低浓度组(P<0.01);Western Blotting实验结果显示,与抑制剂XAV939组比较,对照组、顺铂组、派特灵各浓度组Wnt4蛋白表达量显著升高(P<0.01);派特灵高、中浓度组Wnt4蛋白表达量比派特灵低浓度组显著降低(P<0.01);Western Blotting、免疫组化实验结果显示与对照组比较,顺铂组、抑制剂组、派特灵各浓度组β-catenin蛋白表达量显著减少(P<0.01);与抑制剂XAV939组比较,顺铂组、派特灵各浓度组β-catenin蛋白表达量显著增加(P<0.01)。结论:派特灵可抑制Ect1/E6E7细胞增殖迁移能力且呈一定量效关系,可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。