β-细辛醚对Aβ痴呆损伤过程中ECV304细胞黏附分子表达的影响(英文)

目的:了解Alzheimer’s病中β-淀粉样蛋白沉积在血管内皮细胞给其造成的损伤,以及β-细辛醚对血管内皮细胞黏附分子表达的影响和对血管内皮细胞损伤修复的影响。方法:运用形态学、流式细胞术及MTT法,检测Aβ损伤、正常和β-细辛醚治疗的ECV304细胞的DNA周期,钙离子浓度及CD106,CD62P,CD62E这3种黏附分子表达的变化。结果:β-淀粉样蛋白在血管内皮细胞痴呆损伤过程中,上调其他3种黏性分子和钙离子浓度,造成细胞凋亡;β-细辛醚能下调3种黏性分子的表达和钙离子浓度,减少细胞凋亡。结论:β-细辛醚通过调节某些外周血小板黏附分子和血管间黏附分子和钙离子浓度,减轻β-淀粉样蛋白对血管内皮细胞的痴呆损伤。

人内皮细胞特异性分子-1的转染及其在ECV304中的表达

目的 构建人内皮细胞特异性分子 1(ESM 1)真核表达载体 ,转染人脐静脉内皮细胞系ECV30 4 ,并在ECV30 4中获得表达。方法 将ESM 1cDNA插入真核载体pIRES的多克隆位点中 ,转染人脐静脉内皮细胞。原位杂交 ,免疫组化检测ESM 1基因的表达。结果 构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列分析证实 ,转染后发现ESM 1的表达在转录和蛋白水平都明显的增加。结论 成功构建了人ESM 1真核表达载体和转染了人脐静脉内皮细胞系ECV30 4 ,并获得高水平的表达 ,为进一步研究作好准备。

ECV304内皮细胞株的钙激活非选择性阳离子通道及肿瘤坏死因子-α的抑制作用

目的 研究人脐静脉内皮细胞株 ECV304的钙激活非选择性阳离子通道的特征和肿瘤坏死因子-α (TNF-α )对该通道的调控作用。方法 膜片箝细胞贴附式单通道和全细胞方式记录通道活动。结果 内皮细胞膜的单通道活动可被钙离子激活，通道电导γ =(19.74± 2.35)pS(n=7)，通道平均开放概率 Po=0.260± 0.006(n=5)。通道活动可被 TNF-α抑制，表现为通道电导和开放概率降低，分别为γ 1=(10.69± 4.68)pS(n=5)， Po1=0.230± 0.050(n=5)。用膜片箝的全细胞记录所得结果与单通道记录一致。通道活动还可被氯通道阻断剂蒽 9羧酸 (Anthracene-9-Carboxylic acid, A9C)显著地抑制，将电极液中的 KCl和 NaCl用 K-Aspartate置换，电极液不含氯离子，也记录到单通道活动。其单通道电导为 (18.33± 2.98)pS(n=8)，通道活动也能被 TNF-α和 A9C所抑制，但不能被另一氯通道阻断剂 ZnSO4所抑制。又置换 K-Aspartate为 CsCl未记录到未置换溶液前的结果。 Cs＋难以通过此通道，提示所记录到的通道活动不是钙激活氯通道 ICl(Ca)，而是钙激活非选择性阳离子通道。结论 内皮细胞株 ECV304的非选择性阳离子通道可被肿瘤坏死因子 TNF-α和 A9C所抑制。

BMP-2对ECV304细胞内皮-间质转化功能的影响

目的研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对ECV304细胞内皮-间质转化(EndMT)的影响,并探讨其可能的机制。方法构建慢病毒载体并转染肝癌HepG2细胞,Real-Time PCR与Western blot检测转染效率,转染后的HepG2细胞与ECV304细胞共培养。实验分为上调组(BMP-2表达水平上调的HepG2细胞)、正常组(BMP-2表达水平正常的HepG2细胞)、下调组(BMP-2表达水平下调的HepG2细胞)、Normal组(与正常组HepG2细胞共培养的ECV304细胞)、LV组(LV组,与下调组HepG2细胞共培养的ECV304细胞)和Overexpression-LV-BMP-2组(OE组,与上调组HepG2细胞共培养的ECV304细胞)。Western blot分析EndMT标志物(CD31、VE-Cadherin、FSP-1和a-SMA)的表达水平,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路后观察EndMT标志物的表达水平。结果 Real-Time PCR与Western blot结果显示,与正常组比较,下调组BMP-2 mRNA与蛋白的表达水平降低( P <0.05),上调组HepG2细胞BMP-2 mRNA与蛋白的表达水平增加( P <0.05);与Normal组比较,OE组ECV304细胞内皮相关蛋白(VE-Cadherin、CD31)表达降低及间质相关蛋白(FSP-1、a-SMA)表达增加,LV组ECV304细胞内皮相关蛋白(VE-Cadherin、CD31)表达增加及间质相关蛋白(FSP-1、a-SMA)表达降低( P <0.05);给予PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂LY294002后,VE-Cadherin、CD31表达增加,FSP-1、a-SMA表达降低。结论 BMP-2通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进ECV304细胞的EndMT。

他克莫思对rhHGF刺激ECV304细胞株表达MMP-9的抑制作用

目的 :探讨重组人类肝细胞增殖因子 (rh HGF)刺激 ECV30 4细胞株表达基质金属蛋白酶 - 9(MMP- 9)的作用及他克莫思 (Tacrolimus,FK5 0 6 )的抑制作用。方法 :绘制正常 ECV30 4细胞株生长曲线 ,明确最适生长浓度及对数生长期 ;明确 rh HGF及 FK5 0 6的作用浓度 ;流式细胞仪 (FCM)检测 ECV30 4细胞株的 MMP- 9水平。结果 :1ECV30 4细胞的最适生长浓度为 1.0 E+ 4 / ml,对数生长期为 3～ 5 d;rh HGF的作用浓度为 8ng/ ml,IC50 为 8.2 7ng/ ml;FK5 0 6的作用浓度为 5 0 ng/ ml,IC50 为 5 1.6 3ng/ ml。 2对照组 MMP- 9的表达量为 39.74 % ;培养基中加入rh HGF 8ng/ ml后 ,细胞存活率为 1.38816 9± 0 .10 2 0 33(P<0 .0 1) ,MMP- 9的表达量为 4 0 .32 % ;培养基中加入FK5 0 6 5 0 ng/ ml后 ,细胞存活率为 0 .39876 4± 0 .0 92 4 76 (P<0 .0 1) ,MMP- 9的表达量为 14 .6 1% ;培养基中加入FK5 0 6 5 0 ng/ ml15 min后加入 rh HGF8ng/ ml,细胞存活率为 0 .76 72 0 3± 0 .0 2 6 39(P<0 .0 1) ,MMP- 9的表达量为 35 .0 8%。结论 :rh HGF可刺激 ECV30 4细胞增殖 ,使 MMP- 9的表达量增加 ;FK5 0 6可抑制 ECV30 4细胞增殖 ,使 MMP- 9的表达量降低 ;FK5 0 6可拮抗 rh HGF所引起的 ECV30 4细胞增殖 ,从而使 MMP-

肿瘤坏死因子α和雷公藤内酯醇调节Raji细胞内VEGF的表达及基质胶中ECV304细胞血管形成作用的研究(英文)

为了探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)和雷公藤内酯醇作用Raji细胞VEGF(血管内皮细胞生长因子)的表达及VEGF与ECV血管形成的关系,采用MTT法检测雷公藤内酯醇抑制Raji细胞增殖的影响;用ELISA法对Raji细胞上清的VEGF定量;用基质胶上的内皮细胞网络形成检测ECV304(人类脐静脉内皮细胞起源的细胞系)血管生成;用RT-PCR检测VEGFmRNA含量。结果表明:雷公藤内酯醇对Raji细胞增殖抑制作用呈时间和剂量依赖方式,最适合作用时间为24小时,24小时半数抑制浓度IC50为25nmol/L;Raji细胞上清VEGF的含量在TNF-α组明显高于空白对照组,雷公藤内酯醇处理组则明显低于空白对照组,两者比较有极显著差异(P<0.01);Raji细胞内VEGFmRNA主要为VEGF165和VEGF121,其含量在TNF-α处理组与空白对照组比较有增加,而雷公藤内酯醇抑制VEGFmRNA表达,并呈剂量依赖方式;Raji细胞上清、VEGF(10ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)处理的Raji细胞上清在基质胶中作用ECV304细胞后可促进血管形成,而雷公藤内酯醇(25nmol/L)处理的Raji细胞上清和1640培养基作为的对照组加入基质胶中ECV304细胞未见血管形成。结论:在TNF-α、雷公藤内酯醇作用Raji细胞过程中,TNF-α促进VEGF的表达而雷公藤内酯醇则抑制其表达;TNF-α处理的Raji细胞上清在基质胶中促进血管形成,而雷公藤内酯醇则抑制血管形成。

Minocycline对rhHGF刺激ECV304细胞株表达MMP9的抑制作用

目的探讨重组人类肝细胞增殖因子(recombinant human hepatocyte growth factor,rhHGF)刺激ECV304细胞株表达基质金属蛋白酶-9(matrjx metalloproteinase-9,MMP-9)的作用及米诺环素(minocycline)的影响作用.方法绘制正常ECV304细胞株生长曲线,明确最适生长浓度及对数生长期;明确rhHGF及minocycline的作用浓度;流式细胞仪(flow cytometer,FCM)检测ECV304细胞株的MMP-9水平.结果①ECV304细胞株的最适生长浓度为1.0E+4/mL,对数生长期为3～5d;rhHCF的作用浓度为8ng/mL,minocycline的作用浓度为1.0E-5mol/L.②对照组MMP-9的表达量为39.74%;培养基中加入rhHGF8ng/mL后,细胞存活率为1.388169±0.102033(P＜0.01),MMP-9的表达量为40.32%;培养基中加入minocycline1.0E5mol/L后,细胞存活率为0.294526±0.076829(P＜0.01),MMP-9的表达量为19.92%.③培养基中加入minocycline 1.0E5mol/L 15min后加入rhHGF 8ng/mL,细胞存活率为0.397291±0.099504(P＜0.01),MMP-9的表达量为22 28%.结论rhHGF可刺激ECV304细胞株增殖,使MMP-9的表达量增加;minocycline可抑制ECV304细胞株增殖,使MMP-9的表达量降低;minocycline可拮抗rhHGF所引起的ECV304细胞株增殖,从而使MMP-9的表达量降低.

基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立

目的 建立基于报告基因和干扰素 α(Interferon α)信号通路的药物筛选模型,用于筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。方法 构建带有ISRE(IFN αstimulatedresponseelement)靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入血管内皮细胞 (ECV304 )中,筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受IFN α诱导的阳性克隆。选取相关的细胞因子干扰素 β、干扰素 γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察。结果 ECV304细胞中SEAP的表达受IFN α的诱导并呈现剂量依赖关系,IFN α的最高诱导表达率是IFN β最高诱导表达率的 9 0倍、IFN γ的 8 8倍、PTH的 9 1倍,具有相对特异性。IFN α对ECV304细胞无增殖作用。本方法的Z' 因子为 0 8,说明此模型具有很好的稳定性。结论 本模型的SEAP基因表达水平能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在 96孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平可筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。

脱氢表雄酮对内皮细胞NO,ET-1生成及ICAM-1表达的影响

目的 :观察脱氢表雄酮对内皮细胞NO合成、ET 1分泌及细胞表面ICAM 1表达的影响 .方法 :培养的人脐静脉内皮细胞系ECV30 4经不同浓度和不同作用时间DHEA处理后 ,采用硝酸还原酶及放免法分别测定培养液中NO及ET 1水平 ,用SABC免疫组化法观察细胞表面ICAM 1的表达 .结果 :与对照组相比 ,随着DHEA浓度的增加 ,培养液中NO的含量从 (387± 12 )降至 (2 4 2± 11) μmol/L (P <0 .0 5 ) ,而ET 1的浓度却从 (397± 13)增至 (6 2 6± 2 9)ng/L (P <0 .0 5 ) .随着时间的延长 ,各对照组培养液中NO含量均无明显变化 (P >0 .0 5 ) ,而DHEA组NO生成量却逐渐降低 (P <0 .0 5 ) ,呈时间依赖 .培养液中ET 1浓度无论是对照组还是DHEA组均随时间的延长而升高 (P <0 .0 5 ) ,但DHEA组升高的更为明显 .无论是增加浓度还是延长时间 ,DHEA均不影响细胞表面I CAM 1的表达 .结论 :DHEA可通过调节内皮细胞NO及ET 1生成量对血管功能进行调控 .

消可宁颗粒减少ONOO^-形成 保护高糖条件下内皮细胞的实验研究

目的:观察体外高糖培养条件下,消可宁颗粒对血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(induce nitric oxide synthase,iNOS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)及过氧亚硝酸阴离子(peroxynitrite,ONOO-)的影响。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV-304,分常规培养组、高糖对照组和不同浓度消可宁组,检测NOS和NO的吸光度,计算出活力或含量。用免疫组织化学方法检测ONOO-生成的标记物一硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)的表达。结果与高糖对照组比较,消可宁组eNOS活力明显增加,iNOS活力降低,NO含量下降,NT表达减少。并具有剂量与时间依赖性。结论:消可宁可以抑制iNOS活性,并降低NO含量,减少血管内皮细胞内ONOO-形成而发挥抗氧化作用。

人参皂苷IH901对ECV304细胞增殖和迁移的影响及其分子机制

本文探讨人参皂苷20-O-(β-D-吡喃葡萄糖)-20(S)-原人参二醇皂苷(IH901)对ECV304细胞的增殖和迁移的抑制作用。以不同浓度的IH901体外作用ECV304细胞,采用MTT法检测IH901对ECV304细胞生长的抑制效果和对基质黏附能力的影响,显微镜观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡率,划痕法检测细胞的迁移能力,ELISA检测试剂盒检测VEGF和bFGF在ECV304细胞中的表达,Western blotting检测被激活的cleaved caspase-9和cleaved caspase-3两种蛋白的表达量。结果表明,人参皂苷IH901可能通过抑制ECV304细胞分泌VEGF和bFGF,并上调促凋亡蛋白cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达,从而使得细胞被阻滞在G0/G1期,并且在形态学上观察到典型的细胞凋亡变化,如细胞皱缩,体积变小,伴随核固缩,最终导致人参皂苷IH901对ECV304细胞与细胞外基质黏附能力和细胞迁移能力有明显的抑制作用,且呈时间和浓度依赖关系。

硫氧还蛋白对缺氧/复氧人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的探讨硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)对缺氧/复氧损伤内皮细胞(ECV)的保护作用。方法对体外培养的内皮细胞株ECV304(缺氧/复氧组)及TRX修饰的ECV304(TRX组)进行缺氧/复氧实验,另一组ECV304细胞不作缺氧/复氧作为正常对照组,检测复氧不同时间点细胞培养上清液中丙二醛(MDA)、内皮素-1(ET-1)及一氧化氮(NO)的含量变化。结果正常对照(ECV304组),细胞内的MDA、ET-1及NO含量在24 h内变化不大;转染空载体的ECV304细胞在缺氧3 h时,MDA、ET-1含量显著增加,复氧12 h时,MDA、ET-1含量达到最高,然后缓慢下降;ECV304/Trx组与转染空载体组相比,在3 h及12时,MDA含量极显著下降(P<0.01),而在24 h MDA水平显著下降(P<0.05)。ET-1水平在复氧的各时间点均比有下降,在复氧24 h下降最明显(P<0.01);转染空载体的ECV304细胞在缺氧3h时,NO含量显著下降,复氧12 h时,NO含量下降到最低,然后缓慢上升;ECV304/Trx组与转染空载体组相比,在3 h及12时,NO含量极显著上升(P<0.01),在12 h NO水平最高。ECV304/TRX组与正常对照组相比,在12 h时,有显著差异。结论 TRX能抑制缺氧/复氧对ECV的损伤,对缺氧/复氧环境下的ECV起保护作用。

“人脐静脉内皮细胞系”ECV304实际上是人膀胱癌细胞系T24

细胞系间的交叉污染是全世界生物医学研究领域面临的重大难题之一。多项研究显示18％～36％的人肿瘤细胞系为假细胞系或身份不正确。以往假细胞系的鉴别主要依赖于细胞遗传学技术，由于缺乏准确详细的核型描述，且多数细胞系的核型极为复杂，因此识别假细胞系较为困难。短串联重复序列-聚合酶链反应（STR-PCR）技术的出现使得情况发生了很大的改变，目前已成为鉴定假细胞系最为可靠和迅速的方法，得益于这一技术，近年来大量假细胞系得以识别。

旋覆花内酯抑制炎性因子介导的内皮细胞与单核细胞的黏附

为了观察旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone,ABL)乙酰化衍生物ABLO2对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激的内皮细胞ECV304活化及其与RAW264.7单核/巨噬细胞相互作用的影响,采用Western印迹检测核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)活化以及NF-κB依赖的黏附分子的表达水平,应用电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检查ABLO2预处理及LPS/IFN-γ诱导对NF-κB与DNA结合活性的影响。结果显示,ABLO2显著抑制LPS/IFN-γ诱导的NF-κB核转位和DNA结合活性,同时ABLO2降低NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶(IκBkinases,IKK)的活性,抑制IκB的磷酸化及降解;ABLO2还通过减少血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、基质金属蛋白酶-9(metalloproteinase-9,MMP-9)、黏蛋白-c(tenascin-c)的表达,进而减弱单核细胞与内皮细胞之间的黏附作用。研究结果表明,ABLO2通过抑制IKK活性及IκB降解而抑制NF-κB活化,进而起到抑制NF-κB依赖的黏附分子表达及细胞黏附作用。

同型半胱氨酸诱导内皮细胞炎症损伤及金雀异黄酮的保护作用机制探讨

目的:探讨金雀异黄酮(genistein,GEN)对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导的内皮细胞毒性和炎症的抑制作用及其分子机制。方法:采用MTT法检测细胞活性,倒置显微镜观察细胞形态变化,酶联免疫吸附法(ELISA)检测相关炎症分子白细胞介素-6(IL-6)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)。结果:单独加5.0 mmol/L的Hcy组活力最差,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。显微镜下见对照组细胞呈单层鹅卵石样紧密排列,细胞状态良好,而Hcy 5.0 mmol/L组细胞排列杂乱,凋亡增多,状态也最差。ELISA结果发现,与对照组比较,5.0 mmol/L的Hcy能显著增强IL-6及ICAM-1表达(P<0.01)。然而GEN(10、50、100μmol/L)能够增强细胞活力,显著抑制由Hcy介导的IL-6及ICAM-1表达的增强,大大改善细胞状态,尤其是100μmol/L的GEN(P<0.01)。结论:GEN对Hcy介导的内皮细胞毒性及炎症反应有明显的抑制作用。

磷酸肌醇3激酶／蛋白激酶B通路在脐静脉内皮细胞缺氧诱导因子-1α表达中的作用

组织缺氧是慢性下肢缺血性疾病发生发展的重要原因，其分子机制尚不清楚。本研究旨在观察ECV304细胞缺氧环境下缺氧诱导因子-1a（HIF—l仪）及磷酸肌醇3激酶（P13K）／蛋白激酶B（Akt）信号通路的变化并探讨其意义。

1-磷酸鞘氨醇受体2在LPS介导的内皮细胞高通透性中的作用

目的观察1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)在脂多糖(LPS)刺激后表达的变化,探讨其在LPS介导的内皮细胞高通透性中的作用。方法用不同浓度和时间的LPS刺激培养的ECV304细胞,采用RT-PCR方法检测S1PR2mRNA的变化,Western blot方法检测S1PR2蛋白的变化,TRITC荧光标记白蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值。结果与对照组相比,S1PR2mRNA和S1PR2蛋白在LPS(500ng/ml)刺激24h后以及在LPS(1000ng/ml)刺激12h显著增加(P<0.01);S1PR2拮抗剂JTE-013能显著降低LPS引起的内皮细胞通透性增高(P<0.05)。结论 S1PR2在LPS引起的内皮细胞通透性增高中起着重要的作用。

腺病毒驱动KDR启动子介导CD/TK融合基因系统对血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系,对人脐血管内皮细胞ECV30 4的选择性杀伤作用。方法 将质粒pAdEasy -KDR- CDglyTK在2 93细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的ECV30 4细胞株和不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药5 - 氟胞嘧啶(5 -fuorocytosine ,5 -FC)和/或丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV) ,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果 所得病毒对两种细胞细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加;表达KDR的ECV30 4细胞对前药的具有较高的敏感性,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P均<0 . 0 1) ;融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P均<0 . 0 1) ;且观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测治疗后ECV30 4细胞G1期比率增多及S期细胞减少(P均<0 . 0 1) ,同时,电镜下可见ECV30 4有凋亡和坏死改变。结论 KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人血管内皮细胞。

离子辐射和巨噬细胞对血管内皮细胞的作用

目的 观察在大剂量放射损伤条件下 ,内毒素活化的U93 7对脐静脉内皮细胞ECV3 0 4分泌的细胞因子及其生物学性状的作用。方法 将ECV3 0 4未照射组设为对照组 ,ECV3 0 4+12Gy60 Co照射组和ECV3 0 4+U93 7+12Gy60 Co照射组设为实验组 ,照射后培养 48h ,测定细胞的存活率、细胞周期及凋亡方面的变化 ,运用ELISA法测定培养上清中的TGF -β1和VEGF的浓度变化 ,运用免疫荧光 +流式细胞技术检测细胞表面血管内皮生长因子受体 2表达水平 ,运用逆转录聚合酶链反应检测细胞KDR的mRNA水平。结果 大剂量辐射引起细胞增殖率降低 ,凋亡增加 ,G2 /M期阻滞 ,促进ECV3 0 4分泌VEGF和TGF -β1,提高了KDR的表达 ,巨噬细胞可以缓解细胞增殖率的降低 ,减少细胞凋亡和G2 /M期阻滞 ,进一步提高VEGF的分泌和KDR的表达 ,减少TGF -β1的分泌。结论 放射引起细胞增殖率降低 ,凋亡增加 ,G2 /M期阻滞 ,部分与细胞加强分泌的TGF -β1的抑制作用有关 ;在放射损伤的情况下 。