猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白的原核表达、纯化及活性检测

在大肠杆菌BL21(DE3)中表达乙脑病毒(JEV)EDⅢ蛋白、镍柱纯化并检测表达蛋白。采用RT-PCR方法扩增EDⅢ基因片段,构建重组表达载体p ET-28a-EDⅢ并转化到BL21(DE3)菌,经IPTG诱导蛋白表达,表达可溶性产物经NiNTA亲和层析纯化,最后通过SDS-PAGE和Western-Blot检测表达蛋白。结果成功构建原核表达载体p ET-28a-EDⅢ;EDⅢ蛋白在BL21(DE3)菌已表达,经Ni-NTA获得纯化蛋白,并经Western-Blot检测具有反应活性。

乙型脑炎病毒 EDⅢ蛋白的表达纯化及在 Array-ELISA 方法中的应用

目的：拟在大肠杆菌中高效表达纯化乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白，希望能为乙型脑炎（乙脑）病毒（ JEV）感染血清的诊断试剂盒提供候选抗原。方法针对乙脑病毒的EDⅢ蛋白设计特异的PCR扩增引物，对提取的乙脑病毒RNA进行RT-PCR扩增，获取目的基因并构建重组质粒，将重组质粒转入E．coli BL21中并在IPTG作用下表达目的蛋白。将表达的乙型脑炎病毒EDⅢ抗原系列稀释后与对照抗原同时点制在ELISA微孔板中，采用Array-ELISA技术同时检测临床JEV感染患者及正常人血清，并与间接免疫荧光方法的检测结果进行比较。结果成功克隆了JEV EDⅢ蛋白基因段，并在E．coli BL21中表达，成功获得EDⅢ蛋白。该重组蛋白可用于Array-ELISA方法，进行JEV感染血清的检测，并且与传统免疫学检测方法---间接免疫荧光法结果一致。结论该重组抗原可作为JEV感染血清检测的候选抗原。

四种血清型登革病毒包膜蛋白结构域Ⅲ(EDⅢ)中和抗体的制备及鉴定

目的制备四种血清型交叉反应性的登革病毒包膜蛋白结构域Ⅲ(DENV-EDⅢ)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性及体外中和活性。方法通过毕赤酵母表达具有良好抗原性的1~4型DENV-EDⅢ蛋白,并以四种DENV血清型EDⅢ蛋白混合免疫BALB/c小鼠,采用聚乙二醇融合技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出稳定分泌抗DENV-EDⅢ抗体的杂交瘤细胞,进一步通过间接免疫荧光法对所获得mAb的特异性进行鉴定,并通过改良的酶联免疫斑点微中和实验对所获得的mAb进行体外中和活性测定。结果获得6株特异性针对1~4型DENV-EDⅢ蛋白的mAb和11株特异性针对某一血清型DENV的EDⅢmAb,其中有1株mAb同时对四种血清型DENV有均衡的体外强中和活性,其对四种血清型DENV的半数抑制剂量(IC)分别为(0.05、1.89、0.02、3.91)μg/mL。结论成功筛选获得了一株可同时中和四种血清型DENV的EDⅢ特异性mAb。

登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区的表达和免疫原性鉴定

登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,能够大大减弱抗体依赖增强感染效应,因而是登革热重组蛋白疫苗的首选靶标。通过酵母密码子优化后合成同时包含4种血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区的四价联合DV EDⅢ蛋白序列,随后构建酵母表达质粒,并获得酵母表达菌株,经诱导后四联DV EDⅢ蛋白获得高效表达。通过Western blot、ELISA检测及蛋白质免疫原性鉴定,结果表明登革病毒四联DV EDⅢ蛋白表达质粒构建成功,重组蛋白在毕赤酵母获得高效表达,免疫小鼠后能够介导产生较高水平的血清效价。这表明已获得了能引起有效免疫反应的四型登革病毒EDⅢ蛋白,为登革病毒疫苗的研究提供了良好的基础。

新型登革热疫苗临床前研发

登革热已经成为全球重要的公共卫生问题，由于目前尚无有效的治疗方法，因此，研发登革热疫苗已成为控制该病研究的热点。如今，几个候选登革热疫苗正处于临床试验阶段。一些临床前候选疫苗可能成为高质量的新一代疫苗。此文介绍了登革热疫苗研发的各种技术，着重阐述了临床前疫苗的研发现状。