基于eDNA技术的舟山近海中国团扇鳐定性与定量分析

为探讨环境DNA (environmental DNA, eDNA)技术用于中国团扇鳐监测方面的可行性,同时开展基于eDNA技术的舟山近海中国团扇鳐定性与定量分析。本实验将中国团扇鳐与其同属汤氏团扇鳐COI基因片段序列进行比较分析,使用Primer Express 3.0软件设计中国团扇鳐特异性引物与Taq Man探针。在舟山朱家尖近海设计了A、B、C共3个定置网调查站位,定期收集中国团扇鳐样品。于2017年12月19日、2018年4月13日和2018年7月14日分别采集水样(站位A、B1、B2、C1、C2、D),开展eDNA微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)检测,并将检测结果与水温和采样点进行差异显著性分析。结果显示,不同站位、不同时间的中国团扇鳐eDNA浓度不同,水样采集点对中国团扇鳐eDNA浓度的影响极显著,不同采样点eDNA在不同季节存在极显著差异。研究表明,eDNA检测技术灵敏度高,水温、底质和水深对中国团扇鳐的分布皆有影响。研究结果为其他海域的中国团扇鳐e DNA追踪监测奠定了基础。

eDNA宏条形码技术在城市生物多样性监测中的适用性与展望

城市生物监测是城市生物多样性研究的重要内容之一,但由于城市环境和生物习性的复杂性,传统生物监测方法的应用受到诸多制约。eDNA宏条形码技术能够便捷地从环境中提取DNA片段并扩增与测序,从而快速准确地鉴定生物群落物种成分,近年来已成功应用于自然环境生物监测。文章基于eDNA宏条形码技术的主要优势和特点,探讨该技术应用于城市环境中食物链与生物食性、疫源生物、入侵生物及濒危物种、隐遁生物、特殊区域生物以及大气生物源性污染的监测等方面的适用性,归纳其存在的局限性,并对其发展趋势提出展望。

基于沉积物eDNA评估三疣梭子蟹资源量的方法初探

本文旨在通过沉积物eDNA(environmental DNA)的分析,建立一种快速评估三疣梭子蟹资源量的方法。采用柱状采泥器对莱州湾同一地点(37°30″E、119°20″N)不同深度(0~24 cm,7个深度)进行样品采集,提取不同深度地层沉积物中的eDNA,并以此为模板,运用三疣梭子蟹COI基因通用型引物和特异性引物分别进行普通PCR和实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)扩增,评估莱州湾近年来三疣梭子蟹的资源量变化。结果显示:7个样品的eDNA中均能扩增出700 bp长度的DNA产物,表明在不同深度沉积物所代表的年份均有三疣梭子蟹的存在;通过Clustal X与MEGA 7.0软件比对各序列碱基之间的差异性,发现不同柱深沉积物中的COI基因共出现11个变化位点,包括8个转换位点、2个颠换位点和1个插入位点;qPCR结果显示,8~9 cm处的三疣梭子蟹COI基因拷贝数要大于其他深度地层沉积物,说明此柱深代表的年份中三疣梭子蟹的资源量高于其他年份。利用沉积物eDNA评估莱州湾海域内的三疣梭子蟹资源量的方法,可以打破时间和空间的限制,检测不同年份三疣梭子蟹的资源量的变化。

基于eDNA技术的太湖鱼类多样性调查

基于环境DNA(environmental DNA,eDNA)技术开展太湖鱼类多样性调查,并结合传统形态学鱼类资源调查数据,初步探索eDNA技术在鱼类资源调查中的应用。结果显示:太湖16个点位共检出鱼类8目20科47属54种,其中鲫、蒙古鲌和刀鲚丰度相对较高;eDNA与传统形态学调查共同检出鱼类37种,占eDNA检出鱼类序列总数的91.89%;eDNA检出的鱼类中有45种鱼类在太湖鱼类志中有记载,占检出鱼类序列数的95.09%;2种方法得出的鱼类多样性指数均为太湖东部和太湖南部相对较高、太湖北部和太湖西部相对较低,太湖鱼类的生态类型(洄游性、栖息水层和食性)也高度一致;eDNA技术单个频次检出的鱼类物种数和单个点位的种类检出数均高于传统形态学方法,检出效率较高。综上,eDNA技术可用于鱼类资源调查,且在鱼类物种检出效率上优于传统形态学,与传统检测相结合,可以进一步增加监测调查的可靠性。

基于eDNA技术的珠海外伶仃海洋牧场细菌多样性研究

【目的】探索珠海外伶仃海洋牧场微生物群落组成、序列数、生物多样性等,分析eDNA技术的灵敏度,为珠海外伶仃海洋牧场生态系统管理维护提供参考。【方法】2021年9月在珠海外伶仃海洋牧场设立9个站位点,在表层水下2 m处采样,并对样品进行预处理、DNA提取、PCR扩增、高通量测序,分析微生物种类组成、微生物资源密度和丰度,确定优势种。【结果】通过e DNA技术共检出珠海外伶仃海洋牧场微生物30种,隶属于5门7纲14目19科26属,共检测出779706个OTU(Operational Taxonomic Units)。变形菌门为绝对优势门(占75.06%),其次分别是拟杆菌门(占11.35%)、厚壁菌门(占5.28%)、浮霉菌门(占1.91%)、放线菌门(占1.06%);优势种共有7种,分别是交替假单胞菌、海杆菌、莫拉克氏菌、嗜冷菌、溶藻弧菌、嗜盐单胞菌、鞘氨醇杆菌,其中溶藻弧菌优势度最高(0.19)、为绝对优势种,其次是交替假单胞菌和莫拉克氏菌,优势度分别达到0.13、0.12,为主要优势种。【结论】研究结果揭示了珠海外伶仃海洋牧场的微生物群落信息,探索了eDNA技术在海洋牧场的应用,印证了该技术的高效性和灵敏度,为海洋牧场微生物方面的研究提供基础数据和科学参考。

eDNA技术在水生动物疫病监测中的适用性

使用环境DNA(environmental DNA,eDNA)监测水生系统是一个快速发展的研究方向。eDNA技术采用快速、经济、非损伤性采样方案,更适用于稀有、珍贵的水生动物,或难以收集的野生动物的疫病检测和监测。本文结合世界动物卫生组织(WOAH)水生动物委员会(AAC)讨论性文件,综述了eDNA技术在水生动物疫病监测中样品的收集和处理、方法的验证与确认以及在监测方面的适用性等;提出了eDNA方法无法获得诊断性能的准确评估,不适合用来支持WOAH名录中疫病的无疫声明,但阳性结果可能是可疑病例的适当判定标准等。未来可发挥其优势,进一步尝试将eDNA方法用于出入境食用、种用和观赏用水生动物养殖场、隔离暂养场等水生动物疫病监测,特别是特种高货值水生动物及大型水面水生动物疫病的监测。

实验室养殖条件下麦穗鱼(Pseudorasbora parva)eDNA浓度与生物量相关性曲线的拟合与比较分析

为探究实验室养殖条件下麦穗鱼(Pseudorasbora parva)eDNA浓度与其生物量间关系,根据麦穗鱼线粒体COⅠ基因序列设计特异性引物,通过实时荧光定量PCR(qPCR),得到qPCR标准曲线,采用线性、指数和对数3种模型对麦穗鱼生物量与eDNA浓度的相关性曲线进行拟合和比较分析。结果表明:基于CO I基因设计的引物对麦穗鱼DNA具有特异性扩增,扩增效率为90.94%;qPCR的阈值循环数(Cycle threshold,Ct值)与已知浓度或拷贝数的样品(标准品)间呈现良好的线性关系(R2=0.9952),说明标准品的拷贝数与Ct值之间相关的可信度较好。通过3种曲线进一步拟合比较分析显示:线性模型为麦穗鱼生物量与eDNA浓度间的最佳拟合模型,其R2高达0.9338,y=72.087x+81.978。这表明在本试验条件下,eDNA浓度与麦穗鱼生物量呈正相关性。

海南岛淡水鱼类eDNA宏条形码COⅠ通用引物的筛选

已知的鱼类环境DNA(environmental DNA,eDNA)宏条形码通用引物主要位于线粒体核糖体基因区,这些12S和16S引物存在部分近缘鱼类无法识别及参考序列不足等问题。本研究以海南岛淡水鱼类为调查对象,基于8目26科101属150种鱼类COⅠ序列,筛选出6个侧翼保守区;综合碱基变异、物种鉴定、e DNA降解及高通量测序读长需求,在4个侧翼保守区设计了26条引物,其中6条引物未达到Premier评分要求;72种海南淡水鱼类的首轮PCR结果显示,有11条引物的通用性较高,其中,PCR成功种数≥70且条带亮度均大于marker的引物有5条;次轮PCR结果显示,5条引物相互搭配产生的3(正向)×2(反向)套引物组合的扩增成功率均为100%(72种/72种),经PCR条带长度、亮度筛选后表现最优的引物组合为“HN-A-F4、HN-D-R3”(以下简称HN-COⅠ)。30个水样高通量测序结果显示,HN-COⅠ产生的待分析序列总数、鱼类序列总数、OTUs总数和鱼类OTUs总数分别为MiFish-U的0.77倍(8919976/11532126)、1.22倍(2264965/1863905)、0.85倍(406/477)和1.32倍(86/65);HN-COⅠ产生的鱼类OTUs注释到种、属、科及科以上水平的占比分别为81.40%、11.63%和6.98%,MiFish-U则分别为81.54%、4.62%和13.85%。“引物+水样”的NMDS聚类图形成边界明显的2组(胁强系数=0.15);HN-COⅠ的属内物种扩增子两两遗传距离最小值及平均值均分别是MiFish-U的1.23倍(0.0069/0.0056)和1.57倍(0.1559/0.0994)。室内6个密度组鲤鱼(Cyprinus carpio carpio)“生物量–拷贝数”线性回归方程的相关系数较低,HN-COⅠ及MiFish-U均无法准确反映鲤鱼的生物量。本研究筛选并比较了HN-COⅠ与MiFish-U的优劣,表明HN-COⅠ对海南岛淡水鱼类具有更高的靶向性,不仅在防止微生物、哺乳类等非目标生物e DNA污染方面有优势,而且更有利于海南岛淡水鱼类的检出和准确鉴定。

AeDNA:水生生物eDNA数据库

环境DNA (eDNA)技术是一种生态和生物多样性监测和评价的新手段,完整和准确的参考序列库是eDNA技术应用于水生生物多样性调查的基础。当前,不同水生生物eDNA参考序列还存在诸多问题,如不同类群使用的标记基因不同且资源较为分散,部分参考序列分类不准确,以及针对我国各类水体中水生生物eDNA参考序列不多等。针对上述问题,研究构建了水生生物eDNA数据库(AeDNA, http://aedna.ihb.ac.cn/)。AeDNA整合了DNA条形码和基因组两种类型参考序列。其中18S、28S、ITS、COΙ、12S、rbcL等各类DNA条形码60余万条,涉及2万余种鱼类、1万余种水生植物、1万余种底栖动物、1万余种浮游动物和1万余种浮游植物;基因组包含线粒体、叶绿体等细胞器基因组6199个及万种鱼类基因组计划和万种原生生物基因组计划所产生的物种基因组。涉及的生境有江、河、湖、海、冰川和温泉等各类水环境,尤其数据库构建团队贡献的6万余条参考序列,具有我国丰富的各类水体生境信息。总体来说, AeDNA是一个数据量大、类群覆盖全、准确性高且具有我国水生生物特色的综合性eDNA参考序列库,是水生态和水生生物多样性监测的重要基础资源。

一种基于SOA的eDNA在火电厂的应用框架

在简介厂级监控信息系统和实时历史数据库eDNA的基础上,分析了火电厂信息系统的发展过程和面临的问题,详细阐述了SOA设计思想及其实现,并给出了使用eDNA实现该设计思想的框架以及该框架的应用情况。

eDNA实时数据库在企业能源管理系统中的应用

eDNA实时数据库系统以服务目录为核心,以安全服务为外围,围绕各个服务建立起安全的网络。各个服务独立但相互协作地为客户服务,彼此不相互依附,并深入在整个企业范围内的数据采集上来,以极高的无损压缩方式存储起来,以时间序列频繁变化的数据,能以原有的数据精度和时间精度在线保存多达几十年。实现数据处理与管理、数据监控、能耗平衡监视、统计报表、事件分析等功能,达到减少企业事故、降低能耗的目的。

关于eDNA实时数据库架构的一点理解

本文重点介绍了美国Instep公司开发的eDNA实时数据库系统的架构，通过简明的介绍使用户对本数据库有一个初步的认识和了解，加深后续对eDNA数据库的学习和使用。

环境DNA(eDNA)宏条形码技术对枝角类浮游动物物种鉴定及其生物量监测研究

环境DNA(eDNA)宏条形码(Metabarcoding)技术越来越多地被应用于环境中物种定性识别,但如何定量监测物种在环境中的丰度尚未得到解决。本研究以太湖流域常见的5种浮游动物拟同形溞、大型溞、蚤状溞、多刺裸腹溞、老年低额溞为研究对象,建立了一种基于eDNA宏条形码技术的物种定量方法,并与实时荧光定量PCR(qPCR)相比较,研究了eDNA宏条形码技术多物种定量的准确性。结果表明,PCR引物对eDNA宏条形码的物种检测和定量影响显著。313 bp COI313引物对浮游动物物种覆盖度高,但是物种间DNA扩增的偏好性大,不适用于eDNA宏条形码定量检测。基于COI序列重新设计的短COI116引物能够同时检测出所有5个物种。荧光定量PCR(qPCR)物种拷贝数与物种相对占比呈正相关。eDNA宏条形码所检出每个物种的序列数与qPCR定量拷贝数高度一致。综上,eDNA宏条形码技术可实现对浮游动物物种的半定量检测,在生物多样性监测和生物完整性评价有显著的应用价值。

基于eDNA技术的白洋淀微型生物群落监测

传统形态学监测无法识别绝大多数微型生物,环境DNA(eDNA)宏条形码技术提供了一种新型高效的生物监测手段。以白洋淀为例,采用eDNA宏条形码测序技术,开展白洋淀微型生物群落监测,揭示了白洋淀微型生物群落组成、序列数、多样性等的时空分布,比较了eDNA技术和传统形态学方法对藻类的检出能力,分析了eDNA技术的灵敏度和还原力。结果表明:eDNA宏条形码技术检出白洋淀7个微型生物类群的4569个OTU,分属于567个种,其中细菌(除蓝藻门)最多,原生动物次之,古细菌最少;时间上,白洋淀主要微型生物类群秋季生物多样性最高,夏季次之,微型生物类群的序列数、门与属水平的相对丰度也呈现出明显的季节特征。空间上,优势门类在各采样点的分布大致相似,Epsilonbacteraeota等部分相对丰度较少的门类分布明显不均衡;时间和空间变化均影响白洋淀微型生物群落的组成和分布,季节变化的影响更显著;eDNA比传统形态学方法具有更高的检出能力,二者联合使用更有利于全面获取微型生物组成信息。研究全面揭示了白洋淀微型生物群落信息,探索了eDNA宏条形码技术在北方湿地的应用,印证了该技术的高效性和灵敏度。

微型生物群落eDNA-PFU监测

微型生物群落在水生态系统中起着至关重要的作用,是水生态系统食物链的关键环节,其结构和功能可以很好地反映不同生境的水质特征。《水质微型生物群落监测PFU法》是我国首个生物监测国家标准,被证明是一种快速、经济、准确的监测方法。然而,由于PFU法对专业知识要求较高、费时耗力且不易标准化,严重阻碍了该方法进一步的推广与应用。近年来,环境DNA(eDNA)技术的快速发展突破了微型生物形态鉴定的瓶颈,能高效、准确地鉴定出水环境中包括微型生物在内的各种水生生物。为此,文章提出微型生物群落eDNA-PFU法,即基于eDNA技术改进的PFU法,对微型生物群落进行监测。为了对eDNA-PFU法进行验证,文章针对武汉东湖水体中的原生动物群落开展了预实验,结果表明eDNA-PFU法较传统PFU法覆盖度与灵敏度均更高,可以真实、全面、准确地揭示水体中微型生物群落结构特征。因此,基于eDNA-PFU法的微型生物群落监测有望为湖泊、河流、水库等水体的生态考核提供新一代的生物监测标准。

eDNA宏条形码监测沉积物原生生物群落多样性

原生生物个体小、繁殖快,对污染物敏感,是沉积物环境污染重要指示类群。传统基于形态学的方法难以快速准确地反映沉积物中原生生物的群落组成和物种多样性,严重制约了其在水生态评估中的应用。本研究采用环境DNA宏条形码方法,基于真核18S rRNA基因片段分析了太湖流域沉积物原生生物的群落结构及其时空差异,筛选了可用于太湖流域沉积物生态评估的原生生物指标,建立了基于原生生物的水生态评估方法。结果显示,利用环境DNA技术在太湖流域沉积物共检出原生生物群落有2468个分类单元(OTU),属于13门44纲,至少在2个平行样本出现的OTU占总OTU的84.25%,春季(3月)与秋季(8月)原生生物群落组成差异明显。评价结果表明,目前太湖流域原生生物群落完整性整体处于亚健康和一般水平。

褐菖鲉养殖密度与其eDNA的相关关系探讨

研究以舟山岛礁水域优势鱼种褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)为研究对象,通过与其他5种近缘鱼种COⅠ基因片段序列的比较分析,设计了褐菖鲉特异性引物与Taqman探针;基于K2P模型计算得到褐菖鲉与其他5种近缘鱼种在引物探针区的种间遗传距离,褐菖鲉与日本鬼鲉遗传距离最大(0.3202),而与同属的三色菖鲉种间遗传距离最小(0.2617)。将均重为12.46 g的褐菖鲉按2、4、8、16和32尾分别放入室内5个容积为1 m^(3)的圆形水桶,并在40 m×15 m×0.3 m三个养殖池内分别投放20、40和80尾褐菖鲉,其后的0、8h、16h、1d、1.5d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d及10d进行水样抽取,测定褐菖鲉eDNA浓度。分析结果表明,褐菖鲉eDNA浓度前后变化明显,3d后较为稳定,且与各自群体密度相对应,从相关系数和拟合趋势可以看出养殖密度与其eDNA浓度之间呈线性函数相关关系,为褐菖鲉资源eDNA监测评估奠定基础。

eDNA技术在极地水环境中的应用进展

应用环境DNA(eDNA)技术高效准确地完成极地水生态系统(极区大洋,近岸海域及湖泊、溪流等)中生物的物种鉴别、多样性分析等研究工作,对开发极地地区生物资源、预测全球水生态系统变化趋势和平衡稳定和研究极端生境生态学问题等具有重要价值。近年来,eDNA技术发展迅速,有效地改进了传统方法在水生态系统研究中的缺点,提高了对水生生物的调查工作的效率。文章综述了eDNA技术对极地水环境中的鱼类、底栖生物、浮游生物、浮游细菌、病毒等水生生物的生物多样性分析、物种鉴定、种群结构分析及生态学等方面研究的应用进展。eDNA技术作为一种新兴的生物调查方法,有能力加速更新分子时代的现代生物多样性调查的方法,在研究极地水生生物多样性上具有极大的前景。

基于eDNA宏条形码技术的喀斯特高原人工湖泊鱼类多样性分析

【目的】利用eDNA宏条形码技术探究喀斯特高原人工湖泊鱼类多样性,并综合评估环境因子对鱼类分布的影响,为喀斯特地区水域鱼类多样性评估提供新方法、新思路,也为红枫湖和阿哈湖鱼类保护管理措施的制定积累基础资料。【方法】以红枫湖和阿哈湖为代表采集水样,以Tele 02硬骨鱼类通用引物PCR扩增e DNA,在Illumina NovaSeq 6000测序平台完成高通量测序;对优质序列按照98%相似性进行OTU聚类,生成OTUs表格,通过基因注释获得鱼类物种信息,并以R语言分别进行PerMANOVA分析和冗余分析(RDA)。【结果】在红枫湖鉴定出鱼类32种,隶属于5目11科27属,其中鲤形目鱼类18种,红枫湖南、北湖鱼类群落结构差异不显著(R2=0.08,P=0.562>0.05);在阿哈湖鉴定到鱼类33种,隶属于6目12科28属,其中鲤形目鱼类18种,各采样点检出鱼类总数差异不明显,保持在28~32种。现阶段的红枫湖和阿哈湖鱼类组成以鲤形目鱼类为主,但存在以日鲈目为主的养殖鱼类生态入侵。红枫湖环境因子与鱼类群落结构差异的决定系数(R2)排序为溶解氧(DO)>总溶解固体(TDS)=水温(WT)>pH>离子氨(NH4+),DO(P=0.034)是引起红枫湖各采样点鱼类群落结构差异的主要环境因子;阿哈湖环境因子与鱼类群落结构差异的决定系数(R2)排序为TDS>WT>Tra>NH4+>DO,TDS(P=0.005)是引起阿哈湖各采样点鱼类群落结构差异的主要环境因子。【结论】现阶段的红枫湖和阿哈湖鱼类组成以鲤形目鱼类为主,但存在以日鲈目为主的养殖鱼类生态入侵。eDNA宏条形码技术在喀斯特高原水域鱼类多样性评估方面具有较好的适应性,可快速监测到鱼类群落结构和空间分布,但通用引物可能对某些鱼类存在扩增偏好性;此外,不同人工湖泊水质理化因子特异性较强,研究环境因子与湖泊鱼类群落的关系时应对每个湖泊单独进行评估。

Edna: a Failed Life Mediator Contrasting with Madame Ratignolle and Madame Reisz

The Awakening is about the heroine Edna Pontellier awakes and tries to reset her relation with the world in New Orleans,a place the family chose to spend the summer, where there also are influences working their way to awake Edna. Among them, theeffects from Madame Ratignolle and Madame Reisz are of great importance in the process of Edna's awakening and to her final sui-cide. This dissertation will see how Edna is affected by and distinguished from them, and get the conclusion that Edna fails being alife mediator by contrasting with the two women.