鸡减蛋综合征病毒(EDSV)主要蛋白的结构分析

鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国株ＡＡ－２基因组全长为３２８３８ｂｐ，其编码病毒主要结构蛋白（５２／５５Ｋ、Ⅲａ、五邻体、ｐＶⅡ、ｐＶⅠ、六邻体、１００ｋ、ｐＶⅢ以及纤维蛋白等）的基因依次排列在基因组的中部，Ｅ２区编码ＤＮＡ结合蛋白、ＤＮＡ多聚酶、末端前体蛋白及ＩＶａⅡ的基因也分别排列在ＥＤＳＶ基因组的负链上。对这些蛋白的氨基酸序列进行同源性比较后发现，ＥＤＳＶ的主要蛋白与羊腺病毒（ＯＡＶ）同类物存在不同寻常的高同源性。

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)基因组右末端结构的分析

从中国发病鸡中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥｇｇＤｒｏｐＳｙｎｄｒｏｍＶｉｒｕｓ，ＥＤＳＶ）弱毒株（ＡＡ－２），其基因组全长约为３３ｋｂ。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解ＥＤＳＶ全基因组，构建了以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡ（ＫＳ＋）为载体的右末端片段的克隆（约４．２ｋｂ），对其进行了序列测定和结构分析。该片段全长４１８３个碱基对（ｂｐ），位于基因组右末端８７．３ｍ．ｕ．－１００ｍ．ｕ．。结果显示，该片段与哺乳动物腺病毒右末端Ｅ４区结构不同，与禽Ⅰ型腺病毒代表株ＣＥＬＯ右末端片段亦无同源性。本文为深入了解ＥＤＳＶ基因组结构特点。

鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)基因组E1区结构特点分析

ＥＤＳＶ－７６病毒中国株ＡＡ－２经常规方法提取其病毒ＤＮＡ后，建立了限制性内切酶ＰｓｔＩ水解片段的全基因文库。对其中ＰｓｔＩ－Ｇ片段和ＰｓｔＩ－Ａ片段的正反链进行序列测定，获得ＥＤＳＶＥ１区（０－８．８ｍ．ｕ）的核苷酸序列。经分析，ＥＤＳＶＥ１区具有与其他腺病毒Ｅ１区类似的结构。以大于６０个氨基酸残基为标准，ＥＤＳＶＥ１区共有７个开放读码框架（ＯＲＦ），其中Ｒ１、Ｒ２、ＥｌｂｓＴ和Ｅ１ｂ１Ｔ由ｒ链编码，其余分布在Ｌ链上，而且一些与腺病毒复制、转录有关的基序在ＥＤＳＶＥ１区中也较为保守。

减蛋综合征病毒(EDSV)的分离与鉴定

从河北邯郸某鸡场190d未经EDS疫苗免疫的、突然产蛋下降并出现大量软壳蛋、无壳蛋的鸡群中分离到一株病毒,经理化特性鉴定、单抗Dot-ELISA检测、DNA探针斑点杂交,确定分离到的病毒为EDSV。经限制性核酸内切酶酶切分析,表明分离株与EDSV标准株AV127属于同一个基因型。

鸡源和鸭源EDSV某些分子生物学特性的比较

采用差速高心法纯化鸡源（NE_4株）和鸭源（JE_1株）EDSV后,一方面用酚—氯仿抽提法分别提取两种毒株的核酸,选取EcoR、BamH、I、Bgl I、Bgl、Ⅱ、Kpn、I、Pst I和Hind Ⅲ 7种限制性内切酶对两种毒株的核酸进行酶切图谱分析;另一方面利用SDS—PAGE技术对两种毒株进行多肽分析。酶切结果显示:鸡源株用上述7种酶酶切后分别产生4、4、6、8、5、9、10个片段,共计46个;鸭源株分别产生4、4、5、7、9、10、8个片段,共计47个。两者的酶切结果除EcoR I 的酶切片段数和酶切图形完全相同外其余均存在不同程度的差异。凝胶染色及染色凝胶扫描结果均显示:NE_4株有13条多肽,JE_1株有16条多肽,其中有8条多肽的分子量两者相同。Western Blotting结果显示:NE_4株和JE_1株均有 8条具有免疫原性的多肽,其中2条分子量两者差异明显,其余6条分子量相同。

EDSV分离株NE_4、GC_2 DNA的限制性酶切分析

用限制性内切酶BalⅠ、BalⅡ、BamHⅠ、CtaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅠ、SalⅠ、SmalⅠ、XbaⅠ及EcoR28Ⅰ＋BamHⅠ双酶消化对EDSV分离株NE4、GC2r的DNA进行了酶切分析。结果表明，二个分离株与标准株AV127DNA各酶切片段数及各片段的分子量（kb）未见差异，说明二者与AV127株属于同一基因型。

鸡减蛋综合征病毒(Egg Drop Syndrome Virus,EDSV)巯基内肽酶的基因序列分析

鸡减蛋综合征病毒（ＥｇｇＤｒｏｐＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓ，ＥＤＳＶ）巯基内肽酶的基因序列分析曾力宇１金奇１朱雷１章金钢２殷震２侯云德１关键词鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ），巯基内肽酶（Ｔｈｉｏｌ－ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ），核苷酸序列分析ＥＤＳ病毒...

鸭源和鸡源减蛋综合征病毒(EDSV)酶切图谱的分析

选用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ和ＢｇｌⅠ进行鸭源减蛋综合征（ＥＤＳ）病毒（ＪＥ１株）和鸡源ＥＤＳ病毒（ＮＥ４株）的酶切图谱分析，发现鸭源ＥＤＳ病毒的这些酶切片段分别为９，４，４，６条，而鸡源ＥＤＳ病毒（ＮＥ４株）则为１０，４，４，５条，两者的酶切图形和片段大小有些不同，说明ＥＤＳ病毒宿主不同，即使血清型相同，基因型也有差异。

鸡减蛋综合征病毒(EDSV-76)末端前体蛋白的基因结构分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒弱毒株ＡＡ－２，经常规方法提取其病毒核酸后，组建了完整的限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库，并对其中ＨｉｎｄⅢ（２１．０ｍ．ｕ．）－ＳａｃⅠ（３３．２ｕ．）进行了序列测定。同源比较分析证明：其Ｌ链含编码病毒末端前体蛋白，容量为５８０个氨基酸残基（ａａ）的开放读码框架（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）。由此推导的多肽氨基酸序列及结构特点，如保守序列、核定位信号（Ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）。等与其他腺病毒的相应多肽存在较大差异。本文为阐明腺病毒末端前体蛋白参与ＤＮＡ复制起始的机制提供了新的依据。

EDSV六邻体蛋白基因克隆与原核表达载体构建

应用降落PCR技术扩增出减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因并将其克隆至pMDT18载体上,经酶切、PCR鉴定及测序结果表明插入的片段为目的基因,全长2.733kb,共编码910个氨基酸。切下该目的基因定向克隆至pET28a质粒构建了六邻体蛋白基因原核表达载体pET28ahexon,经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序后证明六邻体蛋白基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误,从而为下一步的表达及进一步阐明EDSV六邻体蛋白基因结构与功能的关系和减蛋综合征基因工程苗的研究奠定了良好基础。

EDSV-HB株六邻体蛋白免疫原性试验

本试验主要对减蛋综合征病毒河北分离株(EDSV-HB)的六邻体(Hexon)基因进行了扩增、克隆、测序、表达及免疫原性的试验。将EDSV-HB株六邻体基因克隆至pET-32a-c(+)原核表达载体进行表达。重组蛋白免疫6周龄鸡,间接ELISA方法检测产生的抗体水平。结果显示,表达的重组蛋白能刺激机体产生较高抗体水平。由此表明,体外表达的六邻体蛋白能够保留天然蛋白具有的抗原性。

EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗对减蛋综合征灭活油乳苗的免疫协同作用

利用所构建的减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因真核表达质粒pcDNA2-hexon和减蛋综合征灭活油乳苗，观察了EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗对减蛋综合征灭活苗的免疫协同作用。结果显示，7日龄时应用核酸疫苗和减蛋综合征灭活油乳苗联合免疫的鸡群，在14～56日龄整个观察期内，胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应，均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中，除在接种后第7天两组鸡的B淋巴细胞增殖OD570值差异不显著外，其余各检测时间两组间均表现为显著或极显著差异）；特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第14天后均表现为差异极显著。而且，HI抗体效价水平也持续性高于单纯灭活油乳苗免疫鸡群，并在免疫接种后35～49d时差异显著。说明EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗与灭活油乳苗联合免疫，可明显提高机体的细胞免疫和体液免疫水平，产生很好的免疫协同作用。

含PHYA基因的EDSV转移载体构建及表达研究

将原核表达载体pET 30中的黑曲霉源植酸酶基因(phyA)亚克隆到真核表达载体pCDNA 3的kpnI-EcoRI位 点。根据pCDNA 3的序列在增强子的上游(209位)和BGH polyA下游(2 049位)设计1对引物HM 1,HM 2扩增出 含phyA基因的表达盒。将此表达盒以平末端连接的方式克隆到减蛋综合征病毒(EDSV)基因组右末端的转移载体 pUHBC的SalI位点,酶切分析鉴定表达盒的方向,得到反向插入重组质粒pEDS-phyA。用Lipofectamine 2000将8 μg pEDS-phyA转染90％满度的鸭胚成纤维细胞,6 h后换生长液,24 h后收获细胞,以pUHBC转染作对照。钼酸胺 法测定试验样品植酸酶酶活为977 U／mL。实验结果表达我们已成功地构建了含植酸酶基因的转移载体,为进一步构 建重组减蛋综合征病毒载体表达植酸酶打下基础。

鸡产蛋下降综合征病毒间接免疫荧光检测方法的建立及应用

为建立检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的间接免疫荧光方法,并对该检测方法的各个步骤进行优化,以鸡产蛋下降综合征病毒多抗血清和FITC标记的兔抗鸡IgG为组合,对一抗和二抗的最适工作浓度和孵育时间进行了优化,对IFA方法进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果表明,检测接种EDSV的96孔细胞培养板时,多抗血清的最适工作浓度为1∶320,孵育时间为45 min;FITC标记的兔抗鸡IgG的最适工作浓度为1∶200,孵育时间为30 min;病毒敏感性试验表明,该方法可以检测到10-2 TCID 50/mL的病毒;多抗血清敏感度试验表明,当多抗血清稀释到1∶1280时仍可见较明显的特异性荧光;特异性试验表明,该方法只针对EDSV,而不与禽副流感病毒4型、鸡新城疫病毒等其他病原反应;批内重复性试验和批间重复性试验结果表明,该方法具有较好的重复性和可靠性。结果表明,建立的间接免疫荧光方法具有较高的灵敏度和较好的稳定性,可为我国禽源性生物材料EDSV的检测提供技术支持,有巨大的市场需求。

EDSV分离株(Hd1株)DNA的限制性酶切分析和克隆

用SDS-ProteinaseK消化EDSV抗原-抗体复合物,苯酚-氯仿抽提DNA,得到了完整的EDSV基因组DNA,用限制性内切酶BalⅠ、BalⅡ、BamHⅠ、ClaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、SmalⅠ、XbaⅠ酶切及EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切消化,对EDSV分离株Hd1的DNA进行了限制性内切酶酶切分析。结果表明,分离株Hd1与标准株AV127DNA各酶切片段数及各片段的相对分子量(kb)未见差异,说明分离株Hd1和标准株AV127属于同一基因型。将EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切得到的7个片段,与双酶切线性化的pUC19载体质粒连接,转化E.coliDH5α,克隆了其中的5个片段。

鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2~7和1∶2~4。亚型鉴定表明,这2种单克隆抗体的轻链均为Kappa型,重链均为IgG1亚型。将基于单克隆抗体9G12和10E11建立的双抗体夹心ELISA方法应用于临床检测EDSV抗原,与荧光定量PCR检测结果的符合率为91.7%。综上,成功筛选出9G12和10E11杂交瘤细胞株,二者分泌抗EDSV特异性抗体,且这2种抗体具有中和EDSV感染活性,可应用于EDSV的临床检测。

致麻鸭产蛋下降的副粘病毒的分离和鉴定

从浙江省某麻鸭养殖基地产蛋锐减的病鸭生殖器官分离到1株致产蛋下降、不致鸭死亡的病毒株(YH99V)。该病毒易感蛋鸭,经SPF鸡胚传至第9代时致病性突然增强,第11代出现对鸡红细胞的血凝特性,通常在42～80h致死SPF鸡胚,EF15EID50为10-4.8。经磷钨酸负染电镜观察,YH99V粒子呈现圆形、杆状形、葫芦状形等多形态,直径70～400nm不等,病毒外表有囊膜,囊膜外层有排列整齐的纤突。病毒粒子和包涵体位于细胞浆内。病毒抵抗力由弱到强依次为0.2%甲醛、24h→56℃、45min→紫外线、1h→乙醚≈氯仿≈37℃、16h→pH9→pH5→1%Try。对人眼结膜易感,鸭眼结膜不易感。接种传代细胞BHK-21、IBRS-2均能引起细胞病变。YH99V株与同样引起鸭产蛋下降的AIV、鸭源EDSV无抗原相关性,而能被禽副粘病毒型阳性血清中和。根据试验结果,初步将YH99V判定为鸭副粘病毒。

鸡减蛋综合征病毒分离株AA－2基因组Hind Ⅲ酶切部分片段的分子克隆

以非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ），经差速离心法纯化，电镜下观察到病毒无囊膜，大小为７０～８５ｎｍ。以蛋白酶Ｋ法抽提病毒基因组，琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量约３４ｋｂ、背景清晰的核酸带。ＨｉｎｄⅢ酶切ＥＤＳＶＤＮＡ可见１０条片段，以ｐＵＣ１９质粒为载体，采用鸟枪法对病毒基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段进行分子克隆，获得１７个重组质粒，通过酶切、斑点杂交鉴定，证实已经成功地克隆到ＥＤＳＶ的５．２４ｋｂ、２．０２ｋｂ、１．６５ｋｂ、１．４７ｋｂ、１．４１ｋｂ等５个ＤＮＡ片段。

不同方法提纯鸡减蛋综合征病毒的比较

通过相关系数的计算与显著性检验，结合病毒蛋白浓度的大小，同时进行电镜观察，证实了由鸭胚增殖的ＥＤＳ病毒采用６０％饱和度的硫酸铵或１０％聚乙二醇（ＭＷ６０００）沉淀法初提后，再经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析法提纯的效果优于ＤＥＡＥ５２纤维素色谱法。