绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。

肠炎沙门菌延伸因子EF-Tu缺失株对环境压力的应答变化

延伸热不稳定因子(EF-Tu)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是在蛋白质合成过程中负责肽链的延伸。为研究肠炎沙门菌EF-Tu的tuf A基因缺失对环境压力的应答变化,本研究利用改进的Red同源重组方法构建肠炎沙门氏菌SM6株的tuf A缺失株,命名为SM6Δtuf A,并鉴定缺失株的形态学变化,分析耐酸性、渗透应力、温度缺氧应力、氧化应力的改变。结果表明缺失株对酸性条件及升温缺氧的耐受与亲本株相似;对渗透压的耐受稍强于亲本株,但差异不显著;对氧化压力的耐受显著弱于亲本株。本研究构建的肠炎沙门氏菌tuf A基因缺失株SM6Δtuf A,为进一步研究EF-Tu在沙门氏菌的生物学和致病机制中的作用奠定了基础。

罗非鱼源无乳链球菌兼职蛋白EF-Tu的克隆、表达及其抗原性检测

为检测罗非鱼源无乳链球菌兼职蛋白EF-Tu(延伸因子Tu,Elongation Factor Tu)的抗原性,本实验克隆了罗非鱼源无乳链球菌HN0303的EF-Tu基因序列,并进行了蛋白相关性质的预测和系统发育树的构建。通过原核表达得到EF-Tu重组蛋白,同时利用纯化的蛋白免疫家兔获得多克隆兔抗EF-Tu重组蛋白血清以用于EF-Tu蛋白抗原性检测。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌HN0303 EF-Tu基因有1个由1197个碱基组成的ORF,编码398个氨基酸。生物信息学分析显示其分子式为C_(1933)H_(3096)N_(532)O_(615)S_(11),分子质量为43.981 ku,理论等电点为4.749;具有多个磷酸化位点,不具有信号肽和跨膜区域;具有保守的EFTu结构域、EF-Tu-II结构域和EF-Tu-Ⅲ结构域,且与其他来源无乳链球菌的EF-Tu蛋白具有很高的同源性;具有较高的抗原指数,表明其可形成多个抗原表位。SDS-PAGE检测发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中,大小约为66.4 ku。Western Blot分析表明,兔抗EF-Tu重组蛋白血清能分别特异性结合菌体蛋白和EF-Tu重组蛋白。同时使用兔抗EF-Tu重组蛋白血清封闭罗非鱼源无乳链球菌HN0303表面的EF-Tu蛋白后,无乳链球菌HN0303粘附EPC(Epithelioma papulosum cyprini,鲤鱼上皮细胞)的能力下降了79.99%±2.43%。本研究表明,原核表达的罗非鱼源无乳链球菌EF-Tu重组蛋白具备较好的抗原性,用其制备的兔抗血清能够较好地抑制罗非鱼源无乳链球菌的粘附,推测其可能为罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的候选蛋白。

基于绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白间接ELISA方法的建立

为解决绵羊肺炎支原体感染的预防问题,建立一种简单、快速、成本低的诊断方法,构建绵羊肺炎支原体EF-Tu基因原核表达载体,诱导纯化重组蛋白并用Western blot分析其反应原性,以重组蛋白为诊断抗原,建立绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法,评估其特异性和灵敏性。结果表明,构建的重组蛋白纯化后,经Western blot证实具有良好的反应原性;间接ELISA反应条件优化显示,抗原稀释度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为50 g/L脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为88.7%。说明试验建立的绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法可以推广使用。

滑液囊支原体贵州株膜蛋白EF-Tu、pdhβ免疫原性分析

为了研究鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)膜蛋白EF-Tu和pdhβ的免疫应答效果,试验针对目的基因设计特异性引物,经PCR扩增并构建原核表达载体,应用相关软件对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,对目的蛋白进行诱导表达并进行动物免疫试验。结果表明:PCR扩增EF-Tu和pdhβ基因得到特异性条带,大小为1185 bp和993 bp;成功构建了重组质粒pET32a-EF-Tu和pET32a-pdhβ;滑液囊支原体贵州分离株(MS-GZ-ZJ株)同其他流行株的EF-Tu基因同源性在99.7%~100%之间,pdhβ基因同源性在99.6%~100%之间,说明MS-GZ-ZJ株EF-Tu、pdhβ基因高度保守;EF-Tu、pdhβ蛋白的分子质量分别为43 ku和35 ku,是稳定的亲水蛋白;EF-Tu蛋白二级结构以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链为主,pdhβ蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。表达的蛋白大小与预期相符,EF-Tu蛋白主要为可溶性表达,pdhβ蛋白主要为包涵体表达;EF-Tu、pdhβ重组蛋白均能与MS阳性血清特异性结合。EF-Tu重组蛋白不能单独诱导细胞免疫应答,而pdhβ重组蛋白能刺激鸡群产生少量的白细胞介素4(IL-4),两个重组蛋白混合能诱导少量的IL-2和IL-4,但比疫苗组低很多;体液免疫应答效果不明确。说明单独使用经预测免疫原性好的蛋白质不一定能诱导动物机体产生良好的反应原性。

迟缓爱德华菌延伸因子EF-Tu的免疫特性研究

EF-Tu是细菌的延伸因子,参与细菌众多生理进程。前期在布鲁氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的研究中,EFTu蛋白的免疫原性已被证实,但在迟缓爱德华菌上关于EF-Tu蛋白的研究还未见报道。为研究迟缓爱德华菌延伸因子EF-Tu的免疫特性,本试验利用原核表达系统表达迟缓爱德华菌EF-Tu蛋白,并利用小鼠模型和斑马鱼模型分别评估该蛋白的免疫原性和免疫保护效果。结果显示,重组蛋白rEF-Tu免疫可以使斑马鱼产生针对迟缓爱德华菌的免疫保护力,保护率为50%。本次研究明确了迟缓爱德华菌EF-Tu蛋白的免疫特性,为迟缓爱德华菌疫苗研发提供了借鉴和参考。

耐热蛋白质延长因子(EF-Tu)的分子和功能的性质(英文)

本文用亲和层析法从Calderobacteriumhydrogenophilum(极端耐热细菌)中分离得到纯的耐热蛋白质延长因子。测得其相对的分子量为51000。该蛋白质对热极其稳定,从膜过滤分析法测定EF-Tu 的活性可知,在80℃加热5 min后,原活性仅仅失去50%。Ouchterlony双向免疫扩散的结果表明,该蛋白延长因子与E.coli 延长因子有着抗原的相似性。而且该因子只含一个半胱氨酸残基,其位置在半胱氨酸81,即肽段T_(13)。Southern 杂交试验的结果显示出C.hydrogenophilum 的染色体DNA 中可能有两个基因编码同一蛋白。

产气荚膜梭菌EF-Tu基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导5h后蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为69ku。间接ELISA方法检测的多抗血清效价为1∶262 144。Western-blot结果证实,重组蛋白与产气荚膜梭菌ATCC13124株制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。Western-blot和间接免疫荧光结果表明,多抗血清能分别与pGEX-EF重组蛋白、ATCC13124菌体裂解液、pcDNA3.1-EF-Tu瞬时转染后的BHK-21细胞及ATCC13124感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合反应。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。

鼠伤寒沙门菌延伸因子EF-Tu蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备鼠伤寒沙门菌延伸因子Tu(EF-Tu)的单克隆抗体,以原核表达并纯化的鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0融合,以间接ELISA筛选出阳性克隆,经5次亚克隆后获得5株稳定分泌抗EF-Tu蛋白抗体的杂交瘤细胞株,遂将其命名为Tu1-A1、Tu1-C4、Tu1-H2、Tu4-C11、Tu9-B9。对这5株单克隆抗体的初步鉴定结果表明,其抗体亚型均为IgG1/κ型。以原核表达的带GST标签的EF-Tu蛋白做Western-blot检测制备的单克隆抗体,证实所制备的单克隆抗体具有良好的反应性。这些单克隆抗体的制备为后期研究EF-Tu蛋白在沙门菌侵入及胞内存活过程中的调控作用奠定了基础。

延伸因子EF-Tu在鼠伤寒沙门菌细胞表面的定位分析

以抗鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体作为检测抗体,应用蛋白质印迹、间接免疫荧光试验和免疫溶菌试验等方法鉴定EF-Tu是否存在于菌体细胞表面。结果显示,鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白可以定位到细菌表面;这是首次证实胞内蛋白EF-Tu可以分泌到鼠伤寒沙门菌菌体表面。这为进一步探究EF-Tu蛋白在沙门菌侵入及胞内存活过程中的调控作用及其分子机制奠定了基础。

链球菌SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法的建立

为建立链球菌的快速定量检测方法,本研究根据链球菌延伸因子EF-Tu基因保守序列设计一对引物,以链球菌DNA为模板通过PCR扩增其197 bp的EF-Tu基因片段,并克隆至p MD18-T载体中。以纯化的重组质粒为标准品建立标准曲线,建立了链球菌SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示在3.98×106拷贝/m L^3.98×102拷贝/μL范围内具有较好的线性关系,相关系数为R2=0.995,最低检出量为39.8拷贝/μL。此外,该方法具有良好的特异性,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等其他细菌的检测结果均为阴性。重复性试验表明,该方法的组内和组间变异系数均低于1.0%。利用该方法对34份疑似链球菌感染病料进行检测,结果显示本研究所建立的方法对链球菌的检出率比常规PCR高14.7%,比细菌分离鉴定方法高29.4%。表明该方法可以用于对链球菌感染的定量研究和流行病学调查。

猪链球菌2型05ZYH33菌株启动子的筛选和鉴定

为了筛选和鉴定用于猪链球菌(S.suis)致病因子和致病机制研究的启动子,本研究通过质谱鉴定了来自S.suis2型05ZYH33菌株的5个高丰度蛋白质,并通过其驱动GFP蛋白和甘露糖苷酶SSU05_1921的表达水平,评估了这5个蛋白相应的基因启动子的强弱。结果显示,这5种蛋白质分别为SSU05_0177、SSU05_0530、SSU05_1503、SSU05_1815和SSU05_1868,相应的5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815和P1868均能够有效驱动GFP在E.coli和S.suis中的高水平表达,但是P1815、P0177和P1868不能驱动SSU05_1921在S.suis中的表达。P0530和P1503能够驱动SSU05_1921在S.suis中的表达,并且P1503启动子驱动GFP和SSU05_1921的表达水平均比P0530启动子驱动的高两倍以上。因此,P0530和P1503是S.suis的强启动子,并且P1503更强于P0530。这在高水平表达GFP用于标记菌体,以及构建无启动子基因的回复突变菌株中发挥关键作用,在S.suis遗传操作中具有很好的应用前景。

滑液支原体WVU1853株热不稳定延伸因子的表达及黏附特性分析

旨在探究滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)热不稳定延伸因子(elongation factor thermo unstable,EF-Tu)的黏附特性。参照GenBank中MS WVU1853株EF-Tu序列,设计引物对Tu-F/Tu-R,利用PCR扩增获得MS EF-Tu基因后,将其克隆入pET-28a(+)构建重组质粒pET-EF-Tu,继而转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导表达。纯化表达产物免疫新西兰兔制备抗血清,进而利用Western blot、ELISA和免疫荧光试验分别分析重组蛋白的免疫原性及EF-Tu在MS中的分布,利用补体介导的杀菌试验分析重组蛋白抗血清的补体介导杀支原体活性,利用黏附及抑制试验分析EF-Tu的黏附特性。结果表明,重组蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,其相对分子质量约43 ku,并具有良好的免疫原性,其抗血清具有补体介导的杀支原体活性;EF-Tu在MS的细胞膜和细胞质中均有分布,且是MS的一种黏附相关蛋白。EF-Tu是MS膜表面黏附相关的免疫原性蛋白,研究结果为深入研究MS EF-Tu生物学功能奠定了基础。

绵羊肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快速检测绵羊肺炎支原体的荧光定量PCR方法,根据EF-Tu基因序列设计合成引物,构建含有EF-Tu基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并用于临床样本的检测。结果显示,本研究建立的方法能特异性扩增绵羊肺炎支原体,与其他病原无交叉反应,最低检测限为5 copies/L,在5×10^4-5×10^9稀释度范围内具有良好的线性关系（r2=0.996）,检测的批内和批间变异系数均小于5%。对临床肺组织样本中绵羊肺炎支原体的检出率（105/134,78%）与基于P113基因的q RT-PCR方法的相符,而对鼻腔棉拭子样本的检出率（27/50,54%）略高于后者（25/50,50%）。对人工感染绵羊肺炎支原体山羊肺的病变部位、病健交界部位和无明显病变部位的检出率分别为1/6、6/6和4/6,确定肺的病健交界部位为最佳采样部位。对采自四川、新疆、青海的439份表观健康羊肺绵羊肺炎支原体的平均检出率分别为48%（61/126）、63%（103/163）和75%（113/150）,提示受检羊群仍存在严重的绵羊肺炎支原体带菌感染情况。该方法的建立对绵羊肺炎支原体感染的监测与快速诊断有重要意义。