三种强启动子和egt基因缺陷在重组核型多角体病毒杀虫剂研发中的意义

核型多角体病毒 (nuclearpolyhedrosisvirus ,NPV)是鳞翅目昆虫的重要病原微生物。采用构建重组高效表达外源毒蛋白的 p10、ph、ocu基因的强启动子 ,以提高野生型NPV的毒力 ;探讨删除杆状病毒中的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶 (ecdysteroidUDP-glucosyltraansferase ,EGT)基因对改良病毒杀虫剂的杀虫效果 。

细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

目的利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,用于开发包虫病新型疫苗以及建立相关血清学诊断方法等研究。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增细粒棘球蚴Eg95和Eg.ferritin基因,采用基因拼接法将Eg95和Eg.ferritin融合,将该融合基因Eg95-Eg.ferritin插入到p Fast Bac DUAL载体中,构建重组转座载体后转化DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf-9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行Western blot鉴定。结果成功克隆了Eg95和Eg.ferritin基因,通过柔性氨基酸linker成功获得了融合基因Eg95-Eg.ferritin,经PCR和酶切鉴定成功构建了重组质粒p Fast Bac DUAL-Eg95-Eg.ferritin,Western blot结果证实表达蛋白能够被包虫病人标准阳性血清识别。结论在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达了细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白,与包虫病人标准阳性血清具有良好的反应性。

人SLPI启动子调控下eGFP基因表达载体的构建与表达

目的构建SLPI基因启动子驱动下EGFP表达载体并验证该启动子在非小细胞肺癌细胞株中的特异调控活性。方法通过PCR方法从人外周血基因组中扩增SLPI启动子,经序列分析后,利用pcDNA3.1(+)和pEGFP构建SLPI启动子调控下EGFP表达载体,以脂质体介导转染入人宫颈上皮癌Hela、肺腺癌A549、SPC-A1和肝细胞癌HepG2细胞中,经G418稳定筛选后,在荧光显微镜下观察该启动子在非小细胞肺癌细胞株中的特异调控EGFP表达的活性。结果克隆出的SLPI启动子序列与Genebank上SLPI基因上游5’末端转录调控区的序列完全一致,稳定转染的细胞株Hela、A549、SPC-A1和HepG2中,CMV启动子控制下的EGFP基因均有表达,发出绿色荧光;而SLPI启动子调控下的EGFP基因在Hela、A549和SPC-A1中有表达,发出绿色荧光,在HepG2中则未见荧光发出。结论钓取的人SLPI启动子在非小细胞肺癌细胞中具有特异调控其下游基因表达的活性,为探索该启动子调控下的抗肺癌基因治疗提供实验基础。

牛瘤胃纤维素酶eg基因在乳酸菌中的克隆表达及酶学性质分析

为构建高效表达的内切葡聚糖酶基因工程菌,本研究以牛瘤胃液中微生物全基因组为模板,通过PCR扩增方法得到eg片段,将其克隆至表达载体pMG36e中获得分泌型表达载体pMG36e::eg;将测序正确后的重组质粒电转导到乳酸菌(Lactococcus lactis NZ9000)中,得到L.lactis NZ9000/pMG36e::eg重组菌株,将发酵上清液通过10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)/丙酮沉淀法浓缩蛋白后,用刚果红染色法和3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)法检测该蛋白酶活性,使用滤纸酶活力(filter paper enzyme activity,FPA)法检测该蛋白酶的总酶活,并对重组内切葡聚糖酶进行酶学性质研究。结果表明:从牛瘤胃微生物中克隆得到一个基因大小为1500 bp左右的条带,该酶分子量为50 kDa左右,经刚果红染色有明显水解圈,水解圈直径为2.32 cm;采用DNS法测定该重组蛋白的酶活为12.4019 U·mL^(−1),用FPA法测定总酶活为12.2469 U·mL^(−1);重组蛋白酶对羧甲基纤维素钠、滤纸、微晶纤维素、脱脂棉均有酶活性;最适反应温度为90℃;最适反应pH为6;其中Cu^(2+)、Mn^(2+)、Ba^(2+)、Zn^(2+)、Co^(2+)等均可以提高重组酶的酶活力,而Fe^(2+)可抑制重组内切葡聚糖酶活力。本试验纤维素酶eg基因在L.lactis NZ9000中的稳定高效表达为提高青贮饲料的营养价值和消化率提供了技术支持。

DNA型EGS抑制HCMV UL97基因的表达及病毒复制

目的研究DNA型外部引导序列对人巨细胞病毒(HCMV)UL97基因的靶向抑制作用及抗病毒作用。方法借助计算机软件(RNAStructure4.5)模拟HCMV UL97 RNA的结构,选择二级结构相对简单且具备核糖核酸酶P(RNase P)底物一级结构序列特征的位点作为候选切割靶位,针对不同靶位设计并合成的DNA型EGS。将各EGS分别与体外转录的HCMV UL97 RNA及纯化的人RNase P体外混合,初步筛选具备靶向引导切割活性的EGS。进一步将体外有效的EGS转入HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HELF),通过Western与Northern印迹法检测EGS在宿主细胞内对靶基因表达的影响。此外,通过空斑试验测定病毒的生长曲线,测定EGS对病毒复制的影响。结果本文设计并合成了针对HCMV UL97基因6个不同靶位的DNA型EGS(EGS_(168)、EGS_(212)、EGS_(313)、EGS_(663)、EGS_(1580)和EGS_(1664))。体外切割试验证实,EGS_(212)、EGS_(313)、EGS_(663)和EGS_(1580)具有明显的靶向引导切割作用。在HCMV感染的宿主细胞中,EGS_(212)和EGS_(1580)均能够沉默病毒UL97基因的表达,并显著抑制病毒的复制,分别使病毒滴度降低高达约300倍和600倍。结论本研究成功获得两种具有抗HCMV潜力的DNA型EGS,为进一步研发新型抗HCMV核酸类药物奠定了基础。

细粒棘球蚴TP_x蛋白的分子特征与反应原性

为明确绵羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,TP_x)蛋白的反应原性,并进一步利用Eg TP_x重组蛋白作为Eg感染诊断中的候选标识分子奠定基础,根据GenBank中Eg TP_x基因的cDNA序列设计特异性引物,以Eg头节为总RNA模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体,经测序验证后亚克隆至表达载体pET-32a中,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对表达的重组蛋白进行纯化及反应原性分析。结果表明:Eg TP_x cDNA全长为582个核苷酸,编码193个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个N端酰基化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)磷酸化位点,4个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点;抗原表位区集中在58~94位和160~188位。重组菌可表达分子量为37ku的重组蛋白,重组蛋白Eg TP_x抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

改进型外部引导序列抑制人巨细胞病毒UL49基因的表达(英文)

外部引导序列(EGS)技术(The EGS-based technology)是一种新型的基因沉默技术,能诱导内源性的核酶P(RNase P)对靶mRNA进行有效切割.以人类巨细胞病毒(HCMV)UL49基因mRNA片段为靶序列,基于前人实验基础上设计出更为精简与高效的改进型EGS(miniEGS),DNA片段长度仅为12bp.构建稳定表达HCMVUL49的细胞系,通过应用荧光定量PCR及Western印迹分别鉴定miniEGS对内源性UL49的抑制效率.结果显示,miniEGS能在HeLa细胞中能达到很高的转染效率(97.9%),并且在转染稳定表达UL49的HeLa细胞系后,发现UL49基因的mRNA与蛋白表达水平都出现明显下降(50%).研究表明,改进型的EGS序列不仅能有效抑制目的基因的表达,同时因其序列设计的精简性与高效性,可更好地应用到以后的抗病毒研究中.

白蚁木质纤维酶昆虫细胞表达体系的构建

本研究以通过基因工程方法建立一种能够在昆虫细胞中表达白蚁内源木质纤维酶的昆虫杆状病毒表达体系为目的。通过克隆白蚁内源纤维素酶EG基因片段,将其连入T载体多克隆位点,筛选后获得重组质粒p18EG1,将EG基因片段与pFastBack1质粒连接,转化筛选后获得pFBEG1重组质粒,转染昆虫细胞后,构建获得带有白蚁内源木质纤维酶基因的重组杆状病毒表达体系的方法。研究结果证明了重组杆状病毒可以有效地携带白蚁内源木质纤维酶基因。利用该表达体系作为白蚁内源木质纤维酶表达途径,进一步加以研究,有望提高木质纤维的降解效率,为高效利用木质纤维转化生产生物质能源开创新的途径。

丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core的构建

目的构建丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core,为进一步研究外部引导序列(external guide sequence,EGS)引导核糖核酸酶P在RNA水平阻断丙肝病毒核心基因的表达做好前期基础。方法将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1-301l质粒于大肠杆菌JMl09内扩增;提取pBRTM/HCV1-301l质粒;从pBRTM/HCV1-301l质粒中PCR扩增出HCV核心基因片段并将其插入pGEM-3Z克隆载体;以得到重组的pGEM-HCV/core克隆载体;最后EcoR I and Hind III双酶切鉴定HCV核心基因克隆载体。结果pGEM-HCV/core克隆载体经双酶切、凝胶电泳证明插入片段与HCV核心基因片段大小相符;经测序证明其插入序列与HCV core基因序列一致。结论成功构建了HCV核心基因的克隆载体pGEM-HCV/core。

牛瘤胃内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌,本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板,首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因,然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达EG蛋白,最后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组内切酶的酶活力,分析其酶学性质。结果表明:成功构建表达载体pET-28a::eg,重组菌株E.coli BL21/pET-28a::eg在28℃用IPTG诱导14 h后纯化得到重组的EG蛋白,EG蛋白大小约为50 kDa,刚果红染色有明显水解圈。用DNS法测得EG的酶活为12.60 U·mL^(−1),滤纸总酶活为3.53 U·mL^(−1)。重组酶在不同底物的反应中,羧甲基纤维素钠为底物的酶活力最高,脱脂棉最低。重组酶的最适温度为40℃,最适pH为7.0。在此条件下,Ca^(2+)、Mg^(2+)、Fe^(2+)、K^(+)、Mn^(2+)等离子均可对重组蛋白EG的酶活力具有促进作用,Zn^(2+)可促进但差异不显著,而Hg^(2+)、Cu^(2+)对EG的酶活力具有抑制作用。本研究构建的重组内切酶菌株可以高效水解纤维素,为内切酶的工业应用奠定了基础。

黑莓RuEGs基因克隆及其不同采后处理下的表达特性

黑莓果实柔软多汁,采后不耐贮藏,因此针对这一性状调控的基因进行深入研究具有实际意义。内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-glucanase,EG)是纤维素酶中的重要酶类,能够分解细胞壁,导致果实的成熟软化,从而影响果实的耐贮性。基于阿魏酸和那他霉素采后处理下黑莓‘Hull’品种果实转录组测序的结果,克隆了差异表达的2个EGs基因,将其命名为RuEG1和RuEG2,并对这2个基因在阿魏酸和那他霉素处理下的表达情况进行分析。结果表明,RuEG1和RuEG2分别含1578和1491 bp开放阅读框,分别编码了525个和496个氨基酸。RuEG1和RuEG2蛋白均属于糖基水解酶第9家族,即含有该家族特有的4个半胱氨酸(Cys)残基、2个氨基酸保守区和1个启动位点。在阿魏酸和那他霉素采后处理下,黑莓成熟果实中RuEG1和RuEG2的表达量均呈现显著下降,说明其表达被抑制。本研究结果将为后续研究EGs基因的结构和功能提供理论基础,同时对探明EG酶在果实成熟软化中的作用具有重要意义。

荔枝果实内切-1,4-β-葡聚糖酶基因(EG)的克隆及其表达分析

采用RT-PCR和RACE相结合的方法,从荔枝果实中分离得到两个内切-1,4-β-葡聚糖酶基因(EG)全长序列,分别命名为LcEG1和LcEG2。推导的LcEG1和LcEG2蛋白均含有4个半胱氨酸Cys残基和两个保守的糖基水解酶启动位点。Northernblotting分析表明,LcEG1mRNA在果皮发育过程中逐渐减弱,而在果肉发育过程中逐渐增强;LcEG2仅在果肉发育的前期表达,在果皮中检测不到其表达。LcEG1在荔枝易裂果品种‘糯米糍’果皮和果肉中的表达均明显强于在不易裂果品种‘淮枝’果皮和果肉中的表达。上述结果表明,LcEG1的表达可能参与荔枝果实发育,并且与裂果密切相关,而LcEG2可能只参与果肉的早期生长。

里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达

内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足,通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体p PIC9K-eg2,并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子,利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115-EGⅡ。重组酶的酶学性质分析显示,该酶分子量50 k Da、最适p H(p H 4.5)略有降低及最适反应温度为60℃,专一性地作用于非结晶纤维素,与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化,该菌摇瓶培养条件:培养温度28℃、起始p H 5.0、接种量2%、每24 h添加甲醇1.5%(V/V)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4 g/L,发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/m L。进一步上罐(5 L)发酵180 h,该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/m L,蛋白含量达到4.16 g/L。重组毕赤酵母P.pastoris GS115-EGⅡ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌,该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。