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EG14-3-3真核表达蛋白的纯化及空间结构的生物信息学预测 被引量:1
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作者 赵商岐 郑佳 +5 位作者 李艳敏 张传山 贾海英 龚巧巧 林仁勇 周晓涛 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第5期532-536,共5页
目的构建真核表达载体pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his,经表达、纯化后获得融合蛋白EG14-3-3-myc-his,并通过生物信息学预测EG14-3-3蛋白的空间结构。方法以pet41a-EG14-3-3为模板PCR扩增EG14-3-3基因的CDS区,经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ... 目的构建真核表达载体pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his,经表达、纯化后获得融合蛋白EG14-3-3-myc-his,并通过生物信息学预测EG14-3-3蛋白的空间结构。方法以pet41a-EG14-3-3为模板PCR扩增EG14-3-3基因的CDS区,经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接到真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his A(-)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his。将质粒转染入293T细胞中表达EG14-3-3-myc-his蛋白,经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定,通过在线网站对EG14-3-3蛋白空间结构进行生物信息学预测。结果成功构建pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his真核表达质粒,表达产物纯化后经SDS-PAGE电泳分析其分子质量为27.9 ku,与预期一致,且以第3次(4℃过夜)洗涤的靶蛋白含量较高。Western blot检测纯化后带有His标签的重组蛋白EG14-3-3-myc-his能被His单克隆抗体识别。生物信息学预测EG14-3-3蛋白无信号肽和跨膜区,其二级结构中的N端为无规则卷曲,之后紧连两个α螺旋,C末端为无规则卷曲和较短的片层结构。结论成功构建了pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his真核表达载体,通过蛋白纯化技术获得高纯度的蛋白。表达的EG14-3-3蛋白含有无规则卷曲,可能为抗原表位所在位置,为进一步研究14-3-3蛋白的功能及应用奠定了实验基础。 展开更多
关键词 细粒棘球蚴 eg14-3-3 真核蛋白表达 生物信息学预测
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Echinococcus Granulosus 14-3-3 Protein:A Potential Vaccine Candidate Against Challenge with Echinococcus Granulosus in Mice 被引量:20
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作者 LI Zong Ji WANG Ya Na +1 位作者 WANG Qi ZHAO Wei 《Biomedical and Environmental Sciences》 SCIE CAS CSCD 2012年第3期352-358,共7页
Objective To investigate the protective immunity against Echinococcus granulosus in mice immunized with rEg14-3-3. Methods ICR mice were subcutaneously immunized three times with rEg14-3-3, followed by the challenge w... Objective To investigate the protective immunity against Echinococcus granulosus in mice immunized with rEg14-3-3. Methods ICR mice were subcutaneously immunized three times with rEg14-3-3, followed by the challenge with Echinococcus granulosus protoscoleces intraperitoneally and then sacrificed after six months of post-challenge to detect the proliferation of splenocytes by MTT assay, and to measure the secretion of IL-2, IL-4, IL-20, and IFN -y by ELISA. The rate of reduced hydatid cyst and the levels of IgE, igG and IgG subclasses in sera were examined. Results Mice vaccinated with rEg14-3-3 and challenged with protoscoleces revealed significant protective immunity of 84.47%. ELISA analysis indicated that the immunized mice generated specific high levels of IgG and the prevailing isotypes of IgG were IgG1 and IgG2a. Splenocytes from mice immunized with rEg14-3-3 showed a significant proliferation response. The secretion of IFN-V and IL-2 increased significantly in the vaccinated mice whereas there was no significant difference in IL-4 and IL-20 levels between vaccinated and control mice. Conclusion The results indicate that the rEg24-3-3 vaccine could induce a high level of protective immunity as a promising vaccine candidate to prevent cystic echinococcosis. 展开更多
关键词 eg14-3-3 Echinococcus granulosus VACCINE IMMUNOPROTECTION
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细粒棘球蚴14-3-3与MKK2酵母双杂交载体的构建及自激活鉴定 被引量:4
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作者 范金亮 邵英梅 +7 位作者 李静 李朝旺 张传山 吕国栋 李亮 王俊华 温浩 林仁勇 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2011年第12期894-897,F0002,共5页
目的构建细粒棘球幼(Eg)14-3-3与MKK2酵母双杂交系统,并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测。方法从Eg cDNA中扩增Eg14-3-3基因和EgMKK2编码序列,将其克隆入酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中,经PCR、限制性酶切鉴定及序列测定正确后,PEG... 目的构建细粒棘球幼(Eg)14-3-3与MKK2酵母双杂交系统,并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测。方法从Eg cDNA中扩增Eg14-3-3基因和EgMKK2编码序列,将其克隆入酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中,经PCR、限制性酶切鉴定及序列测定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株,检测融合蛋白对酵母菌生长的影响和自激活活性。结果扩增Eg14-3-3和EgMKK2基因编码区全长分别为749bp和1 572bp。构建的pGBKT7-Eg14-3-3及pGADT7-EgMKK2重组质粒转化到酵母细胞Y2HGold中,检测表达蛋白对Y2HGold无毒性及自激活作用。结论 Eg14-3-3基因和EgMKK2编码序列表达的蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性和自激活作用,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。 展开更多
关键词 eg14-3-3基因 EgMKK2基因 酵母双杂交 自激活
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