EGCG对猪前体脂肪细胞增殖和分化的作用

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶提取物EGCG的生物活性成分,为了探讨其对猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响,以不同浓度EGCG处理猪前体脂肪细胞,MTT法测定EGCG对猪前体脂肪细胞生长的影响;油红O染色检测猪前体脂肪细胞的形态学变化;油红O染色提取法定量分析脂肪细胞充脂量的变化;半定量RT-PCR检测分化转录因子过氧化物酶体增生物激活受体γ2(PPARγ2)和CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)mRNA表达水平变化。结果显示:EGCG随着浓度的递增显著抑制猪前体脂肪细胞的增殖(P<0·01);低浓度的EGCG(5μmol/L)不影响脂肪细胞分化,而高浓度EGCG(200μmol/L)显著抑制猪前体脂肪细胞分化,同时下调PPARγ2和C/EBPαmRNA表达,本研究结果表明EGCG可抑制猪前体脂肪细胞的增殖和分化。

猪微小RNA⁃15b前体突变对其生物学加工过程及前体脂肪细胞分化的影响

基于在猪微小RNA⁃15b(miR⁃15b)前体(pre⁃miR⁃15b)基因位点第58位碱基上发现了1个C>T突变(+58C>T),本试验旨在探究此突变对微小RNA(miRNA)生物学加工过程以及对猪前体脂肪细胞分化的影响。试验通过构建野生型(pmR⁃miR⁃15bW)和突变型(pmR⁃miR⁃15bM)miR⁃15b过表达载体,分别转染猪原代前体脂肪细胞进行miR⁃15b的过表达试验,然后利用实时荧光定量PCR对比2组细胞pre⁃miR⁃15b和miR⁃15b成熟体的表达量,在体外细胞水平明确+58C>T对miR⁃15b生物学加工过程的影响;随后,诱导转染了不同基因型miR⁃15b过表达载体(pmR⁃miR⁃15bW和pmR⁃miR⁃15bM)的猪前体脂肪细胞成脂分化,利用实时荧光定量PCR对比2组细胞miR⁃15b靶基因叉头框蛋白O1(FOXO1)(可抑制脂肪细胞分化)以及成脂分化相关基因的相对表达量,同时结合油红O染色,明确此突变对猪前体脂肪细胞分化的影响。结果表明:2组细胞miR⁃15b初级转录本(pri⁃miR⁃15b)的表达量没有显著差异(P>0.05),而突变组pre⁃miR⁃15b、miR⁃15b和微小RNA⁃16(miR⁃16)表达量极显著低于野生组(P<0.01);突变组分化前FOXO1相对表达量极显著高于野生组(P<0.01),分化后成脂分化相关基因固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP⁃1c)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)相对表达量极显著低于野生组(P<0.01),脂肪细胞蛋白2(aP2)相对表达量低于野生组(P>0.05);油红O染色结果表明突变组细胞脂滴含量明显低于野生组。综上可知,+58C>T阻碍了pri⁃miR⁃15b到pre⁃miR⁃15b的生物学加工过程,导致miR⁃15b成熟体表达量下降,其靶基因FOXO1相对表达量增高,从而抑制猪前体脂肪细胞分化。

枸杞多糖对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响

枸杞多糖(L.barbarum polysaccharides,LBP)具有抗氧化、降血糖、降血脂、免疫调节等多种功效,然而枸杞多糖在细胞水平上对脂肪细胞分化过程的影响及具体的作用机制,目前尚无深入研究。本研究旨在初步探讨枸杞多糖在3T3-L1前脂肪细胞分化中的作用及其机制。试验采用“经典鸡尾酒法”诱导3T3-L1前脂肪细胞,在细胞接触抑制后2 d(分化第0天),加入诱导剂及不同浓度的枸杞多糖(100µg/mL、200µg/mL、400µg/mL)处理细胞,对照组则不加入药物,分化至第12天时,通过油红O染色分析3T3-L1细胞脂肪积累情况,并采用生化法检测3T3-L1细胞中甘油三酯(TG)的含量;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂肪酸合成酶(FAS)及激素敏感性脂肪酶(HSL)蛋白的表达水平。结果表明,不同浓度的枸杞多糖均能够显著降低3T3-L1细胞中脂滴与甘油三酯的含量(P<0.05),极显著下调PPARγ和FAS蛋白的表达水平(P<0.01),极显著上调HSL蛋白的表达水平(P<0.01)。结果提示,枸杞多糖能够有效抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,减少脂肪细胞的生成和脂质积累,其潜在机制可能与抑制PPARγ相关通路的蛋白表达密切相关。

绵羊前体脂肪细胞分化过程中关键基因时序表达特征研究

为分析绵羊前体脂肪细胞在成脂分化过程中关键基因的表达规律及特点,以3T3-L1细胞系为参照,选取出生20 d的呼伦贝尔羊母羔羊,利用组织块消化法从其尾部脂肪组织中分离前体脂肪细胞,建立原代细胞系。利用鸡尾酒法分别对3T3-L1细胞系和绵羊前体脂肪细胞系进行诱导分化,采用实时荧光定量PCR检测诱导分化过程中关键基因的时序表达。结果显示,绵羊前体脂肪细胞成脂分化用时更长,诱导分化16 d后依然有部分细胞具有分化能力。基因时序表达分析表明,DLK1、SREBP1、ACC1、FASN基因的时序表达趋势在2类细胞中基本一致;ZFP423、ADIPOQ、C/EBPα基因的表达时序在2类细胞系中高度相似;而PPARγ、FABP4、LPL、HSL基因在2类细胞系中的时序表达趋势差异较大。相比3T3-L1细胞系,绵羊前体脂肪细胞中ZFP423、ADIPOQ、C/EBPα、FABP4的相对表达量在诱导分化中、后期仍然处于较高水平,PPARγ、LPL、HSL的相对表达量呈现持续增长趋势,表明绵羊前体脂肪细胞的成脂分化具有自身特点。根据基因表达情况推测,绵羊前体脂肪细胞诱导分化16 d后通过外界环境摄取脂肪酸合成甘油三酯并沉积于细胞,这种较强的吸收外界环境脂肪酸的能力可能是本土绵羊皮下脂肪过度沉积的原因之一。综上所述,对绵羊脂肪代谢的相关研究以绵羊脂肪细胞为模型更加合理,为绵羊脂肪代谢研究提供了可靠的试验模型。

山羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响

旨在克隆山羊KLF8基因序列,阐明组织表达特性,并初步揭示过表达KLF8后对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的潜在影响.利用逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法克隆获得山羊KLF8基因启动子和CDS区序列(coding sequence,CDS),并运用生物信息学方法分析其序列特征;利用基因重组方法构建山羊pcDNA3.1-KLF8真核过表达载体,利用CCK-8、EdU检测方法和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)明确KLF8对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响.结果显示,获得包含2个潜在的核心启动子、多个TATA-Box和GATA-Box的山羊KLF8基因启动子2 001bp和包含KLF家族典型的锌指结构域、发挥转录抑制/激活基序的CDS序列1 062 bp.KLF8高表达于山羊脾脏组织,极显著高于其他组织(P<0.01),中度表达于肾脏和肺脏组织,低表达于背最长肌和股二头肌.过表达KLF8抑制山羊肌内前体脂肪细胞增殖,并且这种作用可能是通过上调CCND1的表达来实现的.结果为明确山羊KLF8基因生物学特征及对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响提供重要的数据支撑.

晋南牛SREBP1基因调控前体脂肪细胞分化的研究

旨在探究SREBP1基因对晋南牛前体脂肪细胞分化的影响,并通过RNA-Seq技术探究该基因在晋南牛前体脂肪细胞分化过程中的调控机制。本研究利用SREBP1基因的过表达载体和siRNA转染晋南牛前体脂肪细胞,油酸诱导分化后采用油红O染色观察脂滴累积情况,检测甘油三酯(triglyceride,TG)含量以探究SREBP1基因对其分化的影响。利用RT-qPCR和蛋白免疫印迹技术(Western blotting,WB)检测过表达SREBP1基因的前体脂肪细胞中相关基因mRNA和蛋白水平变化。RNA-Seq检测干扰SREBP1基因的脂肪细胞,筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行KEGG通路富集分析,并对差异表达基因进行验证,以探究SREBP1基因参与调控晋南牛前体脂肪细胞分化相关的潜在靶基因。每个处理均设置3个重复。结果表明:1)过表达SREBP1基因能够促进前体脂肪细胞内脂滴的累积、极显著提高细胞内TG含量(P<0.01),干扰SREBP1基因则会抑制脂滴形成。2)过表达SREBP1基因后FABP4的mRNA表达量显著升高(P<0.05),FABP7、LPL的表达量极显著升高(P<0.01),WB结果显示FABP4蛋白表达水平明显升高;3)RNA-Seq共筛选到227个DEGs,其中包括67个上调基因和160个下调基因。京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析结果表明差异基因富集到PPAR信号通路和不饱和脂肪酸生物合成等相关通路,干扰SREBP1基因后,差异表达基因FABP4、LPL和FABP7的mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),FABP4的蛋白表达水平也明显降低。由此可知,SREBP1基因对于晋南牛前体脂肪细胞分化具有促进作用,过表达该基因可促进细胞内TG累积,并且极有可能是通过对与脂质分化相关的PPAR信号通路和不饱和脂肪酸生物合成通路的调控实现的。本研究结果为探究SREBP1基因在晋南牛前体脂肪细胞分化过程中的调控机制提供理论参考。

脂肪酸对延边牛前体脂肪细胞UCP1、UCP3的mRNA表达的影响

试验旨在探索前体脂肪细胞受到冷应激后的响应机制,并初步鉴定以单不饱和脂肪酸中的油酸(OA)、肉豆蔻油酸(MOA)对解偶联蛋白1(UCP1)、解偶联蛋白3(UCP3)基因表达的影响,探索以OA、MOA为代表的单不饱和脂肪酸与细胞冷应激之间是否存在关联。以OA、MOA以及延边牛前体脂肪细胞作为试验材料,分别用OA、MOA处理前体脂肪细胞96 h,通过油红O染色和三酰甘油含量的测定来评估前体脂肪细胞内脂肪生成情况,利用qPCR测定UCP1、UCP3基因的相对表达量。再分别对未经处理、OA处理96 h、MOA处理96 h的前体脂肪细胞进行4℃冷应激处理0、6、12、24 h后,分别检测其UCP1、UCP3基因的相对表达量。结果显示:OA组与MOA组均可显著降低UCP1和UCP3基因的表达水平(P<0.05);在冷处理6~24 h后UCP1基因表达量发生显著性上升(P<0.05),冷处理6~12 h的UCP3基因表达量发生显著性降低(P<0.05)。试验发现,OA、MOA处理前体脂肪细胞96 h后,再进行4℃冷应激处理24 h,会导致UCP1基因表达量上升,而UCP3的表达量随着冷应激处理时间的延长而降低,并且试验初步验证了OA及MOA对两种基因具有抑制作用。

非编码RNA对牛前体脂肪细胞分化的研究进展

肌内脂肪含量是评价牛肉等级和价值的重要指标,其取决于肌内前体脂肪细胞的增殖与分化。前体脂肪细胞分化是一个高度协调的过程,受到激素、转录因子、细胞因子及表观调控等多种因素调控。非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)是一类不编码蛋白质的表观遗传学调节因子,在前体脂肪细胞分化过程中发挥重要作用,其鉴定、功能和调节机制研究已成为牛脂肪沉积的研究热点。该文在简单介绍ncRNA分类、作用机制的基础上,详细阐述了miRNA、lncRNA和circRNA等3种类型的ncRNAs在不同品种、不同性别牛脂肪组织中的表达规律及在前体脂肪细胞分化中的研究进展,以期为解析ncRNA调控牛脂肪细胞分化机制奠定理论基础,并为今后ncRNA在肉牛分子育种提高肌内脂肪含量方面的应用提供理论参考。

miR-378-5p通过靶向ATF3对绵羊前体脂肪细胞增殖分化的影响研究

肌内脂肪含量是决定肉质的关键要素,受多种因素影响,其中重要的一项成分为遗传因素。ATF3(活化转录因子3)基因被证明可以抑制肌内前体脂肪细胞的分化,但其在绵羊方面的作用尚未被探索。基于实验室前期对2月龄和12月龄绵羊背最长肌的高通量测序结果,筛选出差异表达的miR-378-5p,通过预测发现miR-378-5p与ATF3可能具有靶向关系。本研究探讨了miR-378-5p靶向ATF3基因对绵羊前体脂肪细胞增殖和分化的影响。采用双荧光素酶报告试验验证了miR-378-5p和ATF3之间的靶向关系。过表达和干扰miR-378-5p后,通过分析实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹结果显示,miR-378-5p通过靶向ATF3负向调控前体脂肪细胞的增殖,正向调控前体脂肪细胞的分化。EdU细胞增殖检测结果显示,miR-378-5p通过靶向ATF3抑制前体脂肪细胞增殖。油红O染色结果显示,miR-378-5p通过靶向ATF3促进前体脂肪细胞分化。本研究结果证实了miR-378-5p靶向ATF3抑制前脂肪细胞的增殖并促进其分化。这一发现提高了目前对绵羊脂肪沉积的理解,为进一步探究绵羊分子育种提供了理论基础。

雷公藤红素抑制前体脂肪细胞成脂分化的作用及机制研究

目的研究雷公藤红素(celastrol,Cela)对前体脂肪细胞(3T3-L1)成脂分化的抑制作用及其具体机制。方法采用CCK-8法确定雷公藤红素处理3T3-L1细胞的最佳浓度;油红O染色及免疫荧光法(脂肪细胞标志蛋白Perilipin1,Adiponectin)检测雷公藤红素对3T3-L1成脂分化不同时期的抑制作用;Western Blot(WB)检测不同浓度雷公藤红素处理后3T3-L1细胞中调控脂代谢以及分化相关蛋白的表达;对未分化(Con)、分化第1天(MDI)、分化第1天同时给药250 nmol·L^(-1)雷公藤红素(MCT)的3T3-L1细胞进行WB检测以及microRNA(miRNA)测序,qPCR验证筛选得到的miRNA,进行KEGG与GO富集分析;过表达mmu-miR-5121 mimics和inhibitor,WB检测相关蛋白的变化,油红O染色检测分化结果。结果Cela处理3T3-L1细胞的最佳浓度为250 nmol·L^(-1)和500 nmol·L^(-1);油红O染色及免疫荧光结果表明250 nmol·L^(-1)与500 nmol·L^(-1)Cela对3T3-L1成脂分化均有显著抑制作用,250 nmol·L^(-1)在3T3-L1成脂分化早期(第1天)便能显著抑制3T3-L1成脂分化;250 nmol·L^(-1)Cela处理3T3-L124 h后,能显著抑制3T3-L1中DFCP1、FAS、ACC、PPARγ等蛋白的表达;分化第1天FAS与ACC表达升高,采用250 nmol·L^(-1)Cela处理后,ACC、FAS蛋白表达显著降低;miRNA测序筛选后q PCR验证结果表明mmumiR-5121在分化第1天减少,但Cela处理后含量增加。转染5121 inhibitor提高了FAS与ACC的含量,5121 mimics则呈现相反作用。单独转染5121 inhibitor可使得3T3-L1分化成熟,而分化同时添加5121 mimics可以有效抑制分化。并且250nmol·L^(-1)Cela可以抑制5121 inhibitor引起的分化。结论250 nmol·L^(-1)雷公藤红素作用于3T3-L1成脂分化早期可显著抑制3T3-L1分化,其可能通过上调mmu-miR-5121的含量,抑制FAS与ACC的表达发挥作用。

牦牛前体脂肪细胞的分离培养及成脂诱导分化

本文旨在建立牦牛前体脂肪细胞的体外分离及原代培养体系,为牦牛脂肪细胞的相关研究提供试验材料和原代细胞培养模型。以高原型牦牛皮下脂肪组织为材料,通过酶消化法和组织块培养法分离前体脂肪细胞,再使用分化培养基诱导其分化为成熟的脂肪细胞,并采用CCK-8检测细胞增殖期间的生长曲线,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DLK-1和PPAR-γ的表达量。结果表明:酶消化法获得的牦牛前体脂肪细胞在24 h后开始贴壁,贴壁细胞形态多样;组织块培养法在第4天才呈现出游离的前体脂肪细胞,且其生长速度较缓慢。前体脂肪细胞的生长曲线整体呈现“S”形。前体脂肪细胞诱导分化后,细胞内部积累大量脂滴,并逐渐分化为成熟的脂肪细胞;相较于原代脂肪细胞,传代后的脂肪细胞生长速度较快。qRT-PCR检测发现,脂肪细胞分化后,DLK-1的表达量显著降低,PPAR-γ的表达量显著升高。综上,无论采用酶消化法还是组织块培养法,均能成功获得牦牛前体脂肪细胞,并可通过诱导使其分化为成熟的脂肪细胞。

ELOVL6基因通过调节Akt信号通路影响牛前体脂肪细胞增殖的机制研究

本文旨在探究ELOVL6基因对牛前体脂肪细胞增殖的影响及其潜在的作用分子机制。本研究利用腺病毒在牛前体脂肪细胞中过表达ELOVL6基因并利用Real-time PCR技术检测过表达效率,利用CCK-8探究ELOVL6对牛前体脂肪细胞增殖的影响;进一步通过RNA-Seq筛选LOVL6基因作用信号通路并用Western Blot等试验验证结果的可靠性。结果表明,过表达ELOVL6促进了细胞增殖(CCK-8)。进一步通过RNASeq测序分析发现,ELOVL6过表达引起的差异基因主要富集在细胞周期、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、脂肪酸延伸、凋亡和mTOR等信号通路。通过Western Blot试验检测到,ELOVL6能够显著上调前体脂肪细胞内p-Akt和tERK1/2蛋白表达量。过表达ELOVL6后FABP4蛋白表达量显著降低,ACSL4蛋白表达水平显著升高。因此,结合前期的研究结果推测ELOVL6可能通过AKT/mTOR/p70S6K参与牛前体脂肪细胞增殖调控。总之,本研究初步揭示了ELOVL6基因在牛前体脂肪细胞增殖中的作用机制,为脂肪沉积过程中通路调控的研究奠定基础。

猪肌内脂肪前体细胞与皮下脂肪前体细胞分化过程中基因差异表达分析

【目的】探讨猪肌内脂肪细胞与皮下脂肪细胞的基因表达差异。【方法】通过改进的胶原酶消化法,分别从猪(大×长二元杂)皮下脂肪组织和背最长肌肌肉组织中分离脂肪前体细胞,用850nmol·L-1胰岛素和50nmol·L-1地塞米松诱导细胞分化,采用油红O提取法测定细胞分化过程中的聚酯水平。同时采用实时荧光定量PCR方法检测细胞分化过程中的转录调控因子基因(PPARγ、C/EBPβ与SREBP-1)、脂肪合成酶相关基因(GPDH、ACC和SCD-1)、脂肪酸转运相关基因(LPL、FAT与AP2)以及肌肉旁分泌因子受体基因(ACVR2B、IL-6R和IGF-1R)的表达模式。【结果】猪肌内脂肪前体细胞诱导后聚酯的速度快于皮下脂肪前体细胞。与此相似,肌内脂肪前体细胞中PPARγ、SREBP-1、SCD-1、LPL、AP2和FAT的mRNA表达在分化后期均显著高于皮下脂肪细胞。肌肉旁分泌因子受体基因ACVR2B、IGF-IR和IL-6RmRNA在皮下脂肪前体细胞随分化程度的增加其表达水平逐渐降低,但肌内脂肪前体细胞ACVR2B却在诱导后不断上调。【结论】建立了猪肌内和皮下脂肪前体细胞的原代培养模型,发现在离体培养条件下猪肌内脂肪前体细胞比皮下脂肪前体细胞具有更强的分化聚酯能力。从在体情况下肌内脂肪的沉积量少,沉积时间晚等现象可以推测肌内脂肪前体细胞的分化有可能受到肌肉旁分泌因子的局部抑制。

绒山羊肌内前体脂肪细胞的基因表达分析

本研究建立了山羊肌内前体脂肪细胞的体外培养模式,以期深入研究山羊肌内脂肪组织发育和脂肪沉积过程中标志基因的表达情况。试验采集1日龄羔羊背最长肌,Ⅱ型胶原酶消化1.5h后依次通过80目、400目筛网过滤,离心,通过差速贴壁法得到增殖旺盛肌内前体脂肪细胞,观察其形态学变化,油红O染色检测细胞内脂肪含量。实时定量PCR法检测LPL、PPAR、FTO、LIPIN基因的表达量。结果表明:原代培养的细胞成分均一,贴壁生长呈短梭状或棱形,具有肌内前体脂肪细胞的形态特征。通过定量分析,FTO mRNA在早期就有较高表达,在分化5~7d达到最高水平,之后维持较高水平,11d表达量显著下降(P<0.05)。LIPIN mRNA在加入诱导剂后出现波动现象。PPARmRNA在整个细胞分化和增殖过程中维持一个较稳定的水平。LPLmRNA在分化早期高表达,随着分化程度的增加表达量逐渐降低。本研究成功建立了山羊肌内前体脂肪细胞原代培养方法,并在体外重现了增殖和分化的过程。基因表达量为FTO>LPL>PPAR>LIPIN,这可为进一步研究脂肪沉积机制及优化山羊肉品品质奠定基础。

白藜芦醇对猪原代前体脂肪细胞的增殖与分化及Sirt1基因转录表达时序的影响

分别以0μmol／L（对照组）、10μmol／L（低剂量组），20μmol／L（中等剂量组），513μmol／L，100μmol／L（高剂量组）的白藜芦醇（Resveratrol，RES）处理体外培养1～3日龄健康仔猪前体脂肪细胞，采用MTT比色法检测细胞活性及增殖状况：油红O染色化学比色法定量分析细胞内脂肪生成及细胞分化程度；RT-PCR法分析Sirt1（sirtuin1）mRNA表达情况，探讨Sirt1对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响及其分子机制。结果表明，脂肪细胞经RES处理后，各组MTT和油红O染色测得的光密度值（OD值）均低于对照组，50μmol／L，100／μmol／L组在96～120h作用极显著（P〈0．01），与中低剂量组差异显著（P〈0．05）；以20μmol／L，100μmol／LRES处理细胞后，Sirt1 mRNA表达量随细胞分化的进行而逐渐升高，100／μmol／L组均显著高于对照组和20μmol／L组（P〈0．05）。RES对猪前体脂肪细胞增殖分化均有一定抑制作用，高剂量RES（513μmol／L和100μmol／L）可显著减少细胞内脂肪的合成、抑制脂肪细胞增殖与分化，Sirt1 mRNA表达量显著升高可能是RES抑制细胞分化的重要原因之一。

山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中内参基因的表达稳定性分析

旨在通过比较9个内参基因在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期的表达水平进而最终确定适合山羊肌内前体脂肪细胞分化调控研究最佳的内参基因。本研究利用胶原酶消化法获得山羊肌内前体脂肪细胞,并以分别诱导0、1、2、3、5和6d的细胞为研究对象,利用荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)技术和geNorm、NormFinder和BestKeeper程序来检测和分析9个候选内参基因(GAPDH、PPIA、18S rRNA、PPIB、UXT、RPLP0、ACTB、EIF3K和TBP)表达的稳定性,并以KLF3和KLF12的实际表达水平进行校正分析。geNorm和NormFinder程序分析表明,UXT稳定性相对最好;而BestKeeper程序分析发现,PPIB表达相对最平稳;3种软件分析结果均表明,同时使用UXT和PPIB可以准确校正在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化不同时期目标基因的表达;通过对KLF3和KLF12表达量的分析发现,选用筛选结果中最稳定(UXT和PPIB、UXT)和最不稳定(EIF3K和18S rRNA)的内参基因进行归一化分析结果有差异。在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中,UXT基因是适合于山羊肌内前体脂肪细胞的成脂诱导分化研究最稳定有效的内参基因,同时使用UXT和PPIB作为内参基因能够获得更加精确的目标基因表达结果,这为后续山羊前体脂肪细胞分化调控相关基因的功能研究奠定了基础。

猪肌源性前体脂肪细胞的分离培养和成脂诱导分化研究

本研究旨在建立猪肌源性前体脂肪细胞的体外培养体系,并探究成脂诱导分化过程中相关基因的表达,为进一步研究调控猪肌内脂肪沉积的分子机制提供试验材料。采集15日龄仔猪的背最长肌组织,使用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离获得前体脂肪细胞,进行原代、传代培养以及成脂诱导,观察细胞形态、测定生长曲线、油红O染色鉴定以及检测成脂关键基因PPARγ、FABP4、C/EBPα、C/EBPβ、ZFP423、SREBP1、PRDM16和HSL在诱导分化过程中的表达量。结果表明,分离的猪肌源性前体脂肪细胞在6～7 h,发现少量细胞开始贴壁,贴壁的细胞呈似圆型、小梭型以及其它不规则形状,经传代后细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,细胞的生长曲线呈S型。添加分化培养基进行诱导后,所有基因在细胞分化的早期均有表达,FABP4、C/EBPα、SREBP1与PPARγ基因在分化早期表达量极显著升高(P <0. 01),在后期表达量极显著下降(P <0. 01),C/EBPβ、ZFP423和PRMD16基因的表达量在分化过程中未见显著变化,HSL的表达量随着分化进行极显著降低(P <0. 01)。在诱导分化12 d左右,油红O染色呈现红色。综上表明,本研究成功建立了猪肌源性前体脂肪细胞的分离与培养体系,进行成脂诱导分化,揭示分化过程中关键基因的表达规律,为进一步研究猪肌内脂肪沉积的分子机制和改善肉质品质奠定基础。

绵羊前体脂肪细胞的原代培养及分化

本试验旨在建立绵羊前体脂肪细胞的原代培养方法,探讨反刍动物脂肪沉积机理。以1日龄羔羊的肾周脂肪组织为试验材料,采用组织块法和酶消化法分离培养前体脂肪细胞,观察形态学变化,测定生长曲线,油红O染色检测细胞内脂肪含量,并用实时定量PCR法检测脂蛋白脂酶、过氧化物体增殖剂活化受体γ、脂肪酸合酶的表达量。结果表明:原代培养的细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高,具有前体脂肪细胞的形态特征和基因表达特性,为绵羊前体脂肪细胞。本试验成功建立了绵羊前体脂肪细胞原代培养方法,并在体外重现了增殖和分化的过程。

胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化的影响

对分离自20日龄雄性SD大鼠附睾和肾周白色脂肪组织的前体脂肪细胞进行原代培养，并采用MTT比色法、油红O染色提取法分析了100～400nmol／L胰岛素对其增殖、分化的影响，同时利用半定量RT-PCR分析了该浓度胰岛素对分化标志基因——脂肪酸合酶（FAS）、乙酰CoA羧化酶α（ACC1）基因mRNA表达的影响。结果显示，胰岛素能有效地促进前体脂肪细胞的增殖和分化（P〈0．05），在400nmol／L以下具有剂量依赖性；胰岛素处理72h能显著提高脂肪细胞FAS和ACC1基因mRNA的表达水平（P〈0．05）。证实胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化有明显促进作用。