EGFP-IgG4融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和IgG4基因的融合蛋白真核表达载体pMM-EGFP-IgG4/WG,转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese HamsterOvary,CHO)中成功表达,并发出绿色荧光,证明pMM-EGFP-IgG4/WG是一种良好的生产分泌型外源融合蛋白的阳性对照.

pEGFP-IFI16表达载体构建及其表达对Hep-2细胞增殖的影响

RT-PCR扩增的IFI16基因连接到pUCm-T载体并测序鉴定,经测序正确的IFI16基因再连接到pEGFP-C1载体构建pEGFP-IFI16重组质粒,重组质粒pEGFP-IFI16转染Hep-2细胞后用荧光显微镜及半定量RT-PCR分析其表达情况,并用流式细胞仪测定细胞生长曲线分析其表达对Hep-2细胞增殖的影响.结果显示pEGFP-IFI16重组质粒构建正确,转染Hep-2细胞后荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,半定量RT-PCR结果显示转染后Hep-2细胞IFI16基因条带亮度明显升高,细胞生长曲线测定结果显示转染后Hep-2细胞从第二天起其增殖速度变慢、至第三天时其增殖速度明显慢于对照细胞的增殖速度.说明成功构建了能在Hep-2细胞中表达EGFP-IFI16融合蛋白的pEGFP-IFI16重组质粒,pEGFP-IFI16重组质粒体表达能抑制Hep-2细胞的增殖.

禽流感病毒HA-M2融合表位与EGFP蛋白在鸭胚成纤维细胞中的表达

本研究选择禽流感病毒H9N2株的HA的两个保守T细胞表位基因和M2基因胞外保守序列(M2e),经人工合成并通过PCR扩增获得HA-M2融合表位基因,将其与含有增强型绿色荧光蛋白的载体pEGFP-N1连接,构建了重组真核表达质粒HA-M2-pEGFP-N1。采用脂质体法转染体外培养的鸭胚成纤维细胞(DEF)后,通过RT-PCR、直接荧光观察和间接免疫荧光检测,结果表明,成功构建了重组真核表达质粒HA-M2-pEGFP-N1,且以HA抗原表位和保守的M2e序列为基础构建的重组蛋白能够在鸭胚成纤维细胞中成功表达。本试验为研制新型的禽流感通用疫苗,进一步探索HA基因与靶细胞相互作用及AIV的感染机理等奠定了基础。

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein gene,EGFP)和人肝细胞再生增强因子(human augmenter of liver regeneration gene,ALR)融合基因表达载体pEGFP/ALR,并将其转染Hela细胞系,用含G 418的DMEM/F12培养液筛选转基因细胞,然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达,用荧光显微镜检测EGFP基因的表达.结果显示:得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体;在转基因细胞中,PCR扩增得到1.7 Kb的ALR条带,蛋白电泳得到57 KD大小条带,与ALR和EGFP融合蛋白大小相符;荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞.在转基因细胞中,EGFP和ALR同时存在并表达,绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达,从而简化了目的基因繁琐的检测手段.

EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体的构建及其转染COS-7细胞条件的优化

目的构建EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化PEI介导基因转染COS-7细胞的条件。方法PCR扩增EGFP和PDGFRβ基因,依次连接至pcDNA3.1(+)质粒中,构建融合基因表达载体H-E-P-pcDNA3.1(+),经PEI介导转染COS-7细胞,并对转染条件进行优化。结果融合基因表达载体经酶切及测序证明构建正确。经PEI介导转染COS-7细胞的最佳条件为:DNA浓度2μg/ml,N/P比值15.5,在无血清条件下转染。此条件适用于滚瓶培养细胞的转染。结论已成功构建了EGFP-PDGFRβ融合基因表达载体,并优化了经PEI介导转染COS-7细胞的条件。

PRV SA株gB基因和EGFP基因在BHK细胞中的融合表达研究

为了研究gB蛋白在细胞内的作用位点,试验以猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)SA株为模板,设计特异性引物,扩增gB基因保守片段;以pEGFP-N1质粒为模板扩增EGFP基因;以gB基因与EGFP基因胶回收产物为模板,用gB基因上游引物及EGFP基因下游引物通过重叠延伸PCR(SOE PCR)技术获得gB/EGFP融合基因;构建pcDNA3.1/gB/EGFP重组表达质粒,转染乳仓鼠肾细胞(BHK细胞),采用Western-blot技术及荧光显微镜检测荧光蛋白在细胞内的表达情况。结果表明:试验成功扩增到300bp的gB基因、760bp的EGFP基因及1060bp的gB/EGFP融合基因;成功构建出pcDNA3.1/gB/EGFP重组表达质粒并转染BHK细胞;Western-blot技术及荧光显微镜检测显示,融合蛋白在BHK细胞中成功表达。说明通过荧光蛋白研究目的蛋白的作用位点是可行的。

eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV_(9)病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性。

EGFP-MAD2融合基因表达载体的构建及功能验证

目的:构建绿色荧光蛋白(EGFP)与有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)融合基因表达载体,并初步验证融合基因的功能。方法:采用PCR技术扩增EGFP-MAD2融合基因,连接入T载体进行序列测定,随后克隆入逆转录表达载体p QCXIP-EGFP-N1获得重组质粒,采用脂质体转染293FT细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期。结果:获得序列正确的EGFP-MAD2融合基因及其表达载体p QCXIP-EGFP-MAD2;EGFP-MAD2基因可在293FT细胞中表达;流式分析显示EGFP-MAD2表达的细胞G2/M期比例增加。结论:构建了EGFP-MAD2融合基因表达载体,EGFP-MAD2融合蛋白的表达可以诱导细胞发生G2/M期阻滞。

nm23-H_1-绿色荧光蛋白融合基因真核表达载体的构建和表达

目的 :构建包含人野生型nm2 3 H1cDNA和绿色荧光蛋白 (GFP)基因的真核表达载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ,用以研究nm2 3 H1逆转肺癌转移表型的分子机制。 方法 :应用基因工程和分子克隆技术 ,将nm2 3 H1 EGFP基因克隆到真核表达载体pLXSN中 ,得到真核重组载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ;脂质体法转染包装细胞系PA317,得到包含nm2 3 H1 EGFP的逆转录病毒 ,并感染人肺癌细胞株L9981。 结果 :构建了pLXSN nm2 3 H1 EGFP逆转录病毒真核表达载体 ,L9981细胞能够表达nm2 3 H1 EGFP融合蛋白。 结论 :成功构建真核表达载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ,并能在L9981细胞中持续、稳定和高效表达nm2 3 H1 EGFP融合蛋白。

颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。

突变型人APP基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合载体的构建

目的构建携带突变型人淀粉样前体蛋白基因(APP695)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合载体。方法在NCBI上查找APP695的序列,设计引物。以pCB6质粒携带的野生型APP695序列为模板,以突变体引物扩增突变型APP695。将突变型APP695与pIRES2-EGFP连接并测序证实。结果经过酶切鉴定、PCR和DNA测序等方法,证实构建的pIRES2-EGFP/APP695突变型质粒载体序列正确。结论成功构建APP695-EGFP融合基因载体,为研究AD发病的分子机制和治疗时的药物筛选奠定基础。

RAI16基因真核表达载体的构建及在HepG2中的表达

目的构建人视黄酸诱导蛋白16(retinoic acid induced 16,RAI16)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP-C1-RAI16,使RAI16-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。方法采用PCR技术,从含有目的基因的质粒克隆模板中钓取并扩增出RAI16全长编码基因,构建RAI16与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP-C1-RAI16,用脂质体转染技术将pEGFP-C1-RAI16导入HepG2,激光共聚焦分析RAI16亚细胞定位及Western blot检测RAI16-EGFP融合蛋白的表达。结果经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实,RAI16基因已正确插入pEGFP-C1中EGFP基因的下游,获得融合基因表达载体pEGFP-C1-RAI16。将pEGFP-C1-RAI16导入HepG2细胞24 h后,激光共聚焦分析显示RAI16-EGFP融合蛋白主要表达于细胞质内。Western blot结果显示,转染pEGFP-C1-RAI16 24、48 h和72 h后,RAI16基因在蛋白水平的表达逐渐增高,而AFP的表达逐渐下调。结论成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-RAI16,并在HepG2细胞中进行了表达。

HSV-1 UL30基因cDNA的克隆及筛选有效siRNA的融合载体构建

目的:克隆HSV-1 UL30 cDNA并测序,构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。方法:从感染HSV-1F株的病变VERO细胞提取总RNA,二次PCR扩增出UL30 cDNA并克隆至pEGFP-N1质粒,测序鉴定序列;将UL30 cDNA4个小片段亚克隆至pEGFP-N1形成pEGFP-N1-Fi融合表达质粒,转染VERO细胞,荧光显微镜观察融合蛋白表达情况。结果:成功克隆出UL30 cDNA,序列对比显示与基因库中的HSV-1F株UL30序列同源性为99.4%;成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体并实现Fi-EGFP融合蛋白的表达。结论:成功克隆出UL30 cDNA,成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。

拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定

为了研究AtWUS基因在橡胶树胚性易碎愈伤组织中的表达对体细胞胚发生的生物学作用,用构建的根癌农杆菌EHA105(携带pCAMBIA2301-35S-AtWUS)对橡胶树胚性易碎愈伤组织进行转化。根据已报道的AtWUS序列设计特异引物,进行RT-PCR和序列分析,同时用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称)构建AtWUS-EGFP融合基因。结果表明:与GenBank上EGFP基因和拟南芥AtWUS序列同源性为100%,分别构建了pCAMBIA2301-35S-AtWUS(含有GUS和NPTII基因)和pER8-AtWUS-EGFP(含有HPTII基因)载体,采用电击转化法转进根癌农杆菌EHA105中。最后,通过GUS检测法鉴定了pCAMBIA2301-35S-AtWUS已经整合到橡胶树中。本研究分别成功构建了组成型植物表达载体pCAMBIA2301-35S-AtWUS和诱导型植物表达载体pER8-AtWUS-EGFP,为橡胶树遗传转化的研究奠定了基础。

截短的丙型肝炎病毒核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因在Sf9细胞中的融合表达

目的构建含截短的HCV核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒表达载体,探讨其在Sf9细胞中的表达和抗原性。方法用PCR法扩增截短的HCV核心蛋白基因片段(Ct)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将其插入转座子载体pFastBac1,构建成重组表达载体pFastCt-EGFP,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒穿梭质粒BacmidCt-EGFP,转染昆虫Sf 9细胞。结果SDS-PAGE和western blot鉴定表明成功表达了分子量约40 000的融合蛋白。以ELISA法检测发现该融合蛋白能与28份抗HCV抗体阳性血清中的15份发生反应,阳性率为53.6%。结论该融合蛋白在昆虫Sf 9细胞中成功表达并具有一定的抗原性。

携带芋兰属LATERAL SUPPRESSOR(LS)-EGFP融合基因植物表达载体的构建

LATERAL SUPPRESSOR(LS)是GRAS家族参与植物分生组织发育的转录因子,是控制植物分枝的关键基因。增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)是目前应用广泛的分子生物学报告基因之一,为筛选转基因植株提供了简便有效的方法。为了探讨LS基因在青天葵及其同属植物广布芋兰中的功能,本研究利用降落-重叠PCR(Touchdown-Overlap Extension PCR,TD-OE PCR)方法,分别构建了两种芋兰属植物LS基因和EGFP融合基因。通过酶切和连接的方法,将融合基因构建到植物双元表达载体p RI 101-AN DNA中,成功获得了两个携带芋兰属植物LS-EGFP融合基因的植物表达载体p RI 101-LS-EGFP,并成功转化至农杆菌,下一步拟用于转化拟南芥,为深入研究该基因功能提供基础。

玉米大斑病菌STK1与EGFP融合基因载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

STK1基因是玉米大斑病菌调控分生孢子发育、渗透胁迫调节和致病性的重要MAPK基因。本文首先构建了含有增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的毕赤酵母GSS115(Pichia pastoris GS115)表达载体p PIC3.5K-EGFP,再以玉米大班病菌模式菌株01-23的菌丝c DNA为模板,PCR扩增STK1基因,克隆到p PIC3.5K-EGFP,构建了STK1-EGFP融合基因的GS115表达载体p PIC3.5K-STK1-EGFP。利用电击转化法将该融合基因表达载体转化到GS115感受态细胞内,利用MD培养基筛选、PCR鉴定,获得了STK1-EGFP融合基因的毕赤酵母转化子。通过RT-PCR和荧光观察,发现STK1基因和EGFP基因均可以高效稳定地表达。另外,在试验中我们还发现,在STK1基因起始密码子前加入Kozak序列可以使STK1-EGFP融合基因的表达强度增强4.8倍。以上研究结果为STK1基因表达蛋白的亚细胞功能定位和抗体制备奠定了基础。

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30基因的转录水平。结果显示,获得的目的基因片段大小与预期结果相符,该基因与Gen-Bank数据库中RPO30基因序列的同源性为97%。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,转染后第48小时,阳性细胞率达到80.1%;经RT-PCR检测,细胞内有RPO30基因的转录。证实,已成功构建了RPO30基因与EGFP基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。