小鼠3T3-L1前脂肪细胞系的特异性标记(英文)

用增强绿色荧光蛋白特异性标记小鼠 3T3 L1前脂肪细胞系 .构建paP2 promoter EGFP载体 ,电穿孔转染小鼠 3T3 L1前脂肪细胞 ,显微荧光观察和RT PCR确认aP2基因的内源表达 .EGFP基因转入 3T3 L1前脂肪细胞 ,观察到细胞分化过程中EGFP表达和脂肪积累 .RT PCR分析表明 ,EGFP代表了稳定而真实的aP2基因的内源性表达 .建立了由脂肪组织特异表达基因aP2的表达控制的EGFP标记的小鼠 3T3 L1前脂肪细胞系 ,目前尚未见用同样方法对前脂肪细胞进行特异性标记 .该细胞系将为脂肪细胞分化机理研究以及为抗肥胖症和抗糖尿病药物筛选提供有力工具 .

小鼠3T3-L1前脂肪细胞系的增强绿色荧光蛋白标记(英文)

细胞模型是研究细胞分化原理以及进行高通量筛选的有效工具。为了建立特异性标记的脂肪细胞分化模型 ,构建了包括脂肪细胞分化特异性表达基因PPARγ2的启动子在内的载体 (pPPARγ2 promoter EGFP) ,用电穿孔方法转染小鼠 3T3 L1前脂肪细胞 ,用显微荧光观察和RT PCR确认PPARγ2基因的内源表达。结果显示 ,EGFP基因成功转入 3T3 L1前脂肪细胞 ,观察到细胞分化过程中EGFP表达和脂肪积累 ,RT PCR分析表明EGFP代表了稳定而真实的PPARγ2基因的内源性表达。建立了由脂肪组织特异表达基因PPARγ2的表达控制的EGFP标记的小鼠 3T3 L1前脂肪细胞系 ,目前国内外尚未见用同样方法对前脂肪细胞进行特异性标记。

中国荷斯坦奶牛MD-2基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建

将中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 (myeloid differentiation protein-2,MD-2) cDNA全长克隆至pEGFP-N1真核表达载体,利用双酶切与测序进行鉴定。经脂质体2000,将pMD-2-EGFP重组质粒转染至HEK293细胞中,应用倒置荧光显微镜、流式细胞术和Western-blot分别检测融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选,获取稳定细胞系。结果发现,目的基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码160个氨基酸。双酶切鉴定和测序结果均表明,MD-2基因编码区正确插入pEGFP-N1真核表达载体,读码框架正确,MD-2-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中,能够成功表达;极限稀释获取单细胞,用250?g/mL的G418筛选得到的细胞系,经流式细胞术和Western-blot检测,在pMD-2-EGFP稳定细胞系组,分子质量约为46 ku处,发现了特异性条带,而pEGFP-N1空载稳定细胞组,以及空白的HEK293细胞对照组,均未发现条带。综上所述,本研究成功构建了真核表达载体pMD-2-EGFP,并在HEK293细胞中能够成功表达;经极限稀释,并利用G418抗性筛选,成功获得了pMD-2-EGFP和pEGFP-N1稳定细胞系,这为进一步研究中国荷斯坦奶牛奶牛MD-2基因的生物学功能奠定基础。

人腺病毒3型检测细胞系的构建与鉴定

目的构建人腺病毒3型(human adenovirus type 3,HAdV3)检测细胞系。方法将HAdV3中的hexon基因克隆至绿色荧光蛋白EGFP3型基因上,连接慢病毒表达载体(PLV-Puro)上,获得PLV-EGFP-hexon。将其与包装质粒P-Pax、PMD用脂质体Lip2000共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒感染HEp-2细胞,经嘌呤霉素压力筛选和系列的释法,获得人腺病毒3型感染的检测细胞系HEp-2/GFP。结果细胞系HEp-2/GFP感染HAdV3后24h,可观察到GFP表达的绿色荧光,而作为对照组的HEp-2/GFP细胞感染双链DNA病毒[如EB病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)等],并未观察到绿色荧光。此检测细胞系用不同滴度的HAdV3感染,至少可以检测到10PFU/ml滴度的HAdV3。结论成功地构建了能检测HAdV3的细胞系HEp-2/GFP,且其检测的特异性和敏感性良好,可以作为检测HAdV3感染的诊断方法之一。

罗格列酮对人黑素瘤细胞株A375体外侵袭能力的抑制及相关机制

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体罗格列酮对人黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响及机制。方法体外培养人黑素瘤细胞株A375；噻唑蓝法（MTT）检测罗格列酮对A375细胞的增殖抑制率；RT—PCR、Western印迹检测罗格列酮对黑素瘤侵袭相关基因基质金属蛋白酶2（MMP2）、组织金属蛋白酶抑制剂2（TIMP2）表达的影响。Matrigel侵袭实验检测罗格列酮对黑素瘤细胞体外侵袭能力的影响。结果MTT结果显示，在24h干预点，罗格列酮浓度为10、25μmol／L时，对A375细胞增殖抑制率分别为（4．86±0．31）％、（5．15±0．52）％，细胞毒性作用不明显。罗格列酮能在mRNA和蛋白水平下调MMP2的表达（P〈0．01），并上调TIMP2mRNA的表达（P〈0．01）。侵袭实验显示，对照组、10μmol／L罗格列酮组、25μmol／L罗格列酮组穿过Transwell小室膜的A375细胞数依次为210．7±14．9，154．1±7．7，87．3±8．1，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论罗格列酮能抑制人黑素瘤细胞株A375的转移，可能与其下调MMP2的表达有关。