pEGFP-N1-omp25荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25基因并构建荧光真核表达载体p EGFP-N1-omp25,检测其在大鼠脑内的表达。方法根据Genebank中omp25基因的核苷酸序列,设计并合成1对引物,以布鲁氏杆菌总基因组DNA为模板,进行PCR扩增得到omp25基因片段,并将omp25基因片段及质粒p EGFP-N1分别进行进行酶切、体外连接,使其定向重组,构建其重组质粒。将制备的重组质粒经侧脑室注射至大鼠,检测p EGFP-N1-omp25在大鼠脑内的表达。结果 PCR扩增出642bp大小的片段,挑取的LB固体培养基上的单菌落经菌液PCR、酶切、测序表明成功构建了p EGFP-N1-omp25荧光真核表达载体。质粒经大鼠侧脑室注射后,脑组织冰冻切片可见荧光表达。结论采用体外重组技术,成功构建了布鲁氏杆菌外膜蛋白omp25基因的真核表达载体,且重组质粒在大鼠脑组织内成功表达。

原代猪成纤维细胞电转染条件的探索

用绿色荧光蛋白基因的DNA(p EGFP-N1)作为目的基因,对原代猪成纤维细胞电转染条件进行探索。结果表明,在电压1 200 V/cm、脉冲时间3 ms、p EGFP-N1添加量4 mg/m L时电转染效率最好。

广西巴马小型猪TRβ1基因真核表达载体的构建及鉴定

本试验为了克隆广西巴马小型猪甲状腺激素受体β1(TRβ1)基因编码序列并构建该基因的真核表达载体,取广西巴马小型猪肝脏组织作为材料,采用RT-PCR技术扩增出TRβ1基因编码序列,与pMD19-T-Simple载体连接,测序正确的重组质粒双酶切后,连接pEGFP-N1载体,构建pEGFP-N1-TRβ1真核表达载体。经双酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-N1-TRβ1转染293T细胞,培养48 h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光蛋白的表达情况。结果表明,本试验成功克隆了广西巴马小型猪的TRβ1基因cDNA序列,序列长度为1 368 bp,编码455个氨基酸,与参考序列的同源性为99.6%,有5处位点突变,且全为同义突变。阳性重组质粒pEGFP-N1-TRβ1转染293T细胞48 h后,在荧光显微镜下观测出绿色荧光表达。

具有双层结构和负电荷屏障载体的构建及其基因转染

用组氨酸分别修饰聚乙烯亚胺（PEI）和透明质酸,得到了聚乙烯亚胺-组氨酸（PEI-His）和透明质酸-组氨酸（HA-His）。然后将PEI-His与增强型绿色荧光蛋白质粒DNA（p EGFP-N1）复合形成PEI-His/DNA复合物（PD复合物）,并进一步在其表面吸附HA-His形成具有双层结构和负电屏障的（PEI-His/DNA）/HA-His复合物（HPD复合物）,用于基因传递研究。透射电镜观察到HPD复合物为球形纳米粒子,水化后平均粒径约为142 nm,ζ电位为-28.9 m V。HPD复合物中加入10%胎牛血清后平均粒径为135 nm,ζ电位为-25.8 m V,提示其具有良好的血清稳定性。HPD复合物对p EGFP-N1的包载效率为（91.9±1.15）%,并可有效保护DNA不被DNase I降解。在PEI浓度5~20μg/ml范围内,HPD复合物的细胞毒性明显低于PEI/DNA复合物,前者细胞存活率可维持在80%以上;同时,它可介导DNA进入细胞实现基因转染,转染效率为2.88%。