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稳定表达HBx和MicroRNA-21基因肝卵圆细胞株构建的试验研究
1
作者
张鸿晖
谢斌辉
《中国当代医药》
2016年第34期4-6,10,共4页
目的研究构建可以稳定表达HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圆细胞株的方法。方法采用LE培养基培养大鼠卵圆细胞株(LE/6),以质粒Pc DNA3.1-HBVx中的HBVx序列为模板,PCR法扩增得到目的基因片段A。将HBx目的基因片段和质粒载体p EGFP-Nl进行双...
目的研究构建可以稳定表达HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圆细胞株的方法。方法采用LE培养基培养大鼠卵圆细胞株(LE/6),以质粒Pc DNA3.1-HBVx中的HBVx序列为模板,PCR法扩增得到目的基因片段A。将HBx目的基因片段和质粒载体p EGFP-Nl进行双酶切,线性化得到重组质粒命名为p EGFP-HBx。重组质粒转化感受态大肠埃希菌DH5a,并进行筛选培养。用脂质体法将质粒转染卵圆细胞,作为p EGFP-HBx组;用脂质体法将质粒转染质粒载体p EGFP-Nl,作为p EGFP-NI质粒组。最后将Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养,培养24 h后用荧光显微镜观察转染细胞的荧光表达情况。结果 p EGFP-HBx中GFP表达量经荧光定量PCR仪器确定为92.28%,且表达程度强;Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养完成后,p EGFP-HBx组内MicroRNA-21的转录水平经仪器测量为1.77±0.24,显著高于p EGFP-NI质粒组内的0.36±0.21,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功地构建了稳定表达HBx和MicroRNA-21基因肝卵圆细胞株,为进一步研究HBx蛋白、mi RNA-21、肝卵圆细胞与肝癌之间的关系提供了实验基础。
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关键词
HBX
Micro
RNA-21基因
肝卵圆细胞
大肠埃希菌DH5a
质粒载体p
egfp-nl
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职称材料
HPV16L1核浆运输的动力学过程
被引量:
2
2
作者
杨军
王一理
司履生
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第6期917-921,共5页
利用增强型绿色荧光蛋白(Enhancegreenflurenscentprotein,EGFP)标记不同的截短型HPV16L1蛋白(Humanpapillomavirustype16L1protein,HPV16L1),分析HPV16L1蛋白核定位信号(Nucleuslocationsignal,NLS)的作用。构建重组pFB-EGFP、pFB-EGFP...
利用增强型绿色荧光蛋白(Enhancegreenflurenscentprotein,EGFP)标记不同的截短型HPV16L1蛋白(Humanpapillomavirustype16L1protein,HPV16L1),分析HPV16L1蛋白核定位信号(Nucleuslocationsignal,NLS)的作用。构建重组pFB-EGFP、pFB-EGFP-HPV16L1、pFB-EGFP-HPV16L1△NLS和pFB-EGFP-NLSHPV16L1p转移载体;在DH10Bac宿主菌内经Tn7转座子介导的同源重组后转染Sf-9细胞,获得重组Ac-EGFP、Ac-EGFP-HPV16L1、Ac-EGFP-HPV16L1△NLS和Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒,感染Sf-9昆虫细胞表达相应截短型HPV16L1融合蛋白;利用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察不同融合蛋白的荧光特性和核浆转运动力学过程。结果发现Ac-EGFP杆状病毒感染的Sf-9细胞内明亮的绿色荧光均匀分布;重组Ac-EGFP-HPV16L1和Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒感染的Sf-9细胞,明亮的绿色荧光主要位于细胞核内;重组Ac-EGFP-HPV16L1△NLS杆状病毒感染的Sf-9细胞,绿色荧光局限于细胞浆内,细胞核内无绿色荧光。说明HPV16L1蛋白羧基端的23个氨基酸(GKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL)具有完全核定位作用,能引导HPV16L1蛋白和EGFP突破核膜屏障进入Sf-9细胞核内。
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关键词
人乳头瘤病毒16型
核定位信号
核浆运输
增强型绿色荧光蛋白
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职称材料
多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送
被引量:
5
3
作者
吴国清
朱旭东
+3 位作者
刘娟
党颖
李少林
黄培堂
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
2004年第5期61-63,19,共4页
增强型绿色荧光蛋白与蛋白质转导结构域TAT、SV40大T抗原的核定位信号以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达 ,纯化后转导A431细胞 ,大部分细胞核内都可以观察到绿色荧光 ,说明TAT NLS可以有效介导蛋白质的入核递送。这种蛋白质递送系统可...
增强型绿色荧光蛋白与蛋白质转导结构域TAT、SV40大T抗原的核定位信号以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达 ,纯化后转导A431细胞 ,大部分细胞核内都可以观察到绿色荧光 ,说明TAT NLS可以有效介导蛋白质的入核递送。这种蛋白质递送系统可望用于转录治疗等研究领域。
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关键词
TAT
核定位信号
增强型绿色荧光蛋白
蛋白质转导结构域
细胞核
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职称材料
题名
稳定表达HBx和MicroRNA-21基因肝卵圆细胞株构建的试验研究
1
作者
张鸿晖
谢斌辉
机构
赣南医学院第一附属医院急诊外科
出处
《中国当代医药》
2016年第34期4-6,10,共4页
基金
江西省自然科学基金资助项目(2012ZBAB205001)
江西省科技厅支撑计划项目(20112BBG70037)
江西省赣州市指导性科技计划任务(2011)
文摘
目的研究构建可以稳定表达HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圆细胞株的方法。方法采用LE培养基培养大鼠卵圆细胞株(LE/6),以质粒Pc DNA3.1-HBVx中的HBVx序列为模板,PCR法扩增得到目的基因片段A。将HBx目的基因片段和质粒载体p EGFP-Nl进行双酶切,线性化得到重组质粒命名为p EGFP-HBx。重组质粒转化感受态大肠埃希菌DH5a,并进行筛选培养。用脂质体法将质粒转染卵圆细胞,作为p EGFP-HBx组;用脂质体法将质粒转染质粒载体p EGFP-Nl,作为p EGFP-NI质粒组。最后将Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养,培养24 h后用荧光显微镜观察转染细胞的荧光表达情况。结果 p EGFP-HBx中GFP表达量经荧光定量PCR仪器确定为92.28%,且表达程度强;Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养完成后,p EGFP-HBx组内MicroRNA-21的转录水平经仪器测量为1.77±0.24,显著高于p EGFP-NI质粒组内的0.36±0.21,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功地构建了稳定表达HBx和MicroRNA-21基因肝卵圆细胞株,为进一步研究HBx蛋白、mi RNA-21、肝卵圆细胞与肝癌之间的关系提供了实验基础。
关键词
HBX
Micro
RNA-21基因
肝卵圆细胞
大肠埃希菌DH5a
质粒载体p
egfp-nl
Keywords
HBx
MicroRNA-21 gene
Hepatic oval cell
Escherichia coli DH5a
Plasmid vector pEGFP-N1
分类号
R735.7 [医药卫生—肿瘤]
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职称材料
题名
HPV16L1核浆运输的动力学过程
被引量:
2
2
作者
杨军
王一理
司履生
机构
西安交通大学医学院附属第二医院病理科
西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所生物医学信息工程教育部重点实验室
出处
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第6期917-921,共5页
基金
国家自然科学基金(30300305)~~
文摘
利用增强型绿色荧光蛋白(Enhancegreenflurenscentprotein,EGFP)标记不同的截短型HPV16L1蛋白(Humanpapillomavirustype16L1protein,HPV16L1),分析HPV16L1蛋白核定位信号(Nucleuslocationsignal,NLS)的作用。构建重组pFB-EGFP、pFB-EGFP-HPV16L1、pFB-EGFP-HPV16L1△NLS和pFB-EGFP-NLSHPV16L1p转移载体;在DH10Bac宿主菌内经Tn7转座子介导的同源重组后转染Sf-9细胞,获得重组Ac-EGFP、Ac-EGFP-HPV16L1、Ac-EGFP-HPV16L1△NLS和Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒,感染Sf-9昆虫细胞表达相应截短型HPV16L1融合蛋白;利用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察不同融合蛋白的荧光特性和核浆转运动力学过程。结果发现Ac-EGFP杆状病毒感染的Sf-9细胞内明亮的绿色荧光均匀分布;重组Ac-EGFP-HPV16L1和Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒感染的Sf-9细胞,明亮的绿色荧光主要位于细胞核内;重组Ac-EGFP-HPV16L1△NLS杆状病毒感染的Sf-9细胞,绿色荧光局限于细胞浆内,细胞核内无绿色荧光。说明HPV16L1蛋白羧基端的23个氨基酸(GKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL)具有完全核定位作用,能引导HPV16L1蛋白和EGFP突破核膜屏障进入Sf-9细胞核内。
关键词
人乳头瘤病毒16型
核定位信号
核浆运输
增强型绿色荧光蛋白
Keywords
Human papillomavirus type 16 (HPV16)
Nucleus location signal (NLS)
Nucleocytoplasmic transport
Enhanced green fluorescent protein (EGFP)
分类号
R373 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送
被引量:
5
3
作者
吴国清
朱旭东
刘娟
党颖
李少林
黄培堂
机构
军事医学科学院生物工程研究所
重庆医科大学
出处
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
2004年第5期61-63,19,共4页
基金
国家"973"计划资助项目 ( 2 0 0 2CB5 13 2 0 4)
文摘
增强型绿色荧光蛋白与蛋白质转导结构域TAT、SV40大T抗原的核定位信号以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达 ,纯化后转导A431细胞 ,大部分细胞核内都可以观察到绿色荧光 ,说明TAT NLS可以有效介导蛋白质的入核递送。这种蛋白质递送系统可望用于转录治疗等研究领域。
关键词
TAT
核定位信号
增强型绿色荧光蛋白
蛋白质转导结构域
细胞核
Keywords
TAT NLS eGFP PTD
分类号
Q26 [生物学—细胞生物学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
稳定表达HBx和MicroRNA-21基因肝卵圆细胞株构建的试验研究
张鸿晖
谢斌辉
《中国当代医药》
2016
0
下载PDF
职称材料
2
HPV16L1核浆运输的动力学过程
杨军
王一理
司履生
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006
2
下载PDF
职称材料
3
多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送
吴国清
朱旭东
刘娟
党颖
李少林
黄培堂
《中国生物工程杂志》
CAS
CSCD
2004
5
下载PDF
职称材料
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