大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定

SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3(SNAT3)是System N中的一员.它在大脑谷氨酸-谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明,EGFPSNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能.

EML3与H3K4M融合蛋白表达质粒的构建及蛋白的表达与纯化

目的:研究获得N端/C端融合组蛋白H3K4M小肽的EML3融合蛋白的方法。方法:将组蛋白H3(aa1~15)小肽编码区融合进表达EML3 Agenet结构域重组质粒中,得到N端/C端融合表达H3K4M的质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经扩大培养,加入IPTG后在15℃条件下诱导6×His标签EML3融合蛋白的表达。经镍柱亲和层析及凝胶过滤层析进行纯化后,通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测蛋白的纯度。结果:通过质粒单点突变、质粒酶切、PCR克隆以及同源重组连接,成功构建EML3 N/C端融合组蛋白H3K4M的重组质粒,测序证实序列正确,而且重组质粒可在大肠杆菌中成功诱导融合蛋白的表达。其中EML3C端融合组蛋白H3K4M可通过凝血酶酶切从而得到游离的H3K4M小肽以及EML3 Agenet结构域蛋白。结论:成功构建EML3融合组蛋白H3K4M重组质粒,并诱导表达及纯化得到高纯度的EML3融合蛋白。

草原兔尾鼠GST-LZP3融合蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 :在原核中表达并纯化草原兔尾鼠卵透明带 3 (zonapellu cida3 ,ZP3 ) ,并以其作为抗原 ,制备抗ZP3的抗血清。方法 :将LZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX 4T 1中。经酶切和序列分析后 ,用重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,并经丙基β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST LZP3融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清。抗血清的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。结果 :成功地构建GST LZP3融合蛋白表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST LZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST LZP3融合蛋白的高效价抗血清。结论 :获得原核表达的GST LZP3融合蛋白并制备了兔抗LZP3的抗血清 。

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用。方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因。通过重叠PCR技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和BglII双酶切后插入真核表达载体pIRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FP/B7-H3-Fc重组载体。脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定。该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白。通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响。结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌。结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用。

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定

目的 构建重组质粒pET2 8a -Sj14 - 3- 3,并在大肠杆菌中表达 ,检测表达产物的免疫活性。 方法 用亚克隆技术把Sj14 - 3- 3基因克隆至 pET2 8aT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α和BL2 1感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE和Westernblot分析。结果 获得pET2 8a -Sj14 - 3- 3重组表达载体 ,SDS -PAGE和Westernblot显示Sj14 - 3- 3基因在 pET2 8a中表达的融合蛋白约为 32 4kDa ,与天然 14 - 3- 3蛋白具有相同的免疫活性。 结论 日本血吸虫信号蛋白14 - 3- 3在原核细胞中得以高效表达 ,表达产物具有免疫活性 。

鼠透明带3(ZP3)融合蛋白表达以及抗血清制备

鼠透明带 3(mZP3)作为精子的初级受体 ,是鼠透明带中的一种主要糖蛋白 ,抗鼠透明带 3抗体能够阻断精卵的结合 ,达到不育的效果 ,因此mZP3是免疫避孕研究的重要候选抗原。从小鼠卵巢中提取总RNA ,分离mRNA ,反转录获得cDNA ,将cDNA连接到测序载体pUCm -T质粒上 ,通过序列测定和分析得到正确的mZP3cDNA。经内切酶EcoRI和XhoI处理 ,将mZP3cDNA克隆至融合蛋白表达载体pGEX - 4T - 1中 ,在T4DNA连接酶的作用下构建出融合表达载体pGEX -mZP3,转化大肠杆菌BL - 2 1菌株 ,利用IPTG诱导后获得可溶性的蛋白质产物 ,经过SDS -PAGE鉴定 ,表达的融合蛋白GST -mZP3分子质量约为 72kD左右 ,纯化的融合蛋白免疫兔子 ,获得效价为1∶1 0 0 0的抗血清 ,Westernblot检测抗血清具有针对mZP3融合蛋白的专一性 。

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合蛋白诱导小鼠免疫应答

目的研究细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合蛋白免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法 56只SPF级雌性Balb/c小鼠随机均分7组,分别为重组Bb-Eg95-EgA31皮下注射组(A组)、肌肉注射组(B组)、鼻腔内接种组(C组)、口服灌胃组(D组)、空载体对照组(E组)、Bb对照组(F组)和Bb培养用液体培养基(MRS)对照组(G组)。免疫后8周各组鼠用50个Eg原头节攻击,攻击25周后,处死小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE和脾细胞上清液IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平;MTT法测定脾细胞增殖反应;流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T细胞百分比和脾细胞凋亡发生率。结果重组Bb-Eg95-EgA31免疫组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平升高,IgG3和IgE降低;脾IFN-γ、IL-12和TNF-α水平升高,IL-10水平降低;脾T淋巴细胞明显增殖;脾CD4+和CD8+T细胞显著增加;脾细胞凋亡发生率显著降低。结论细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-E-gA31融合蛋白能诱导小鼠产生有效的保护性免疫应答。

PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用。方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2+分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白。流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用。结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白。通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力。结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础。

猪卵透明带-3β融合蛋白在E.coli中的表达和鉴定

对全长猪卵透明带－３β（ｐＺＰ３β）ｃＤＮＡ的５端重新测序分析，发现文献报道的该克隆基因５端非编码序列中漏读了两个碱基，继而选择符合ｐＺＰ３βｃＤＮＡ阅读框的ｐＷＲ４５０－２载体质粒，通过双酶切构建了β－半乳糖苷酶／ｐＺＰ３β融合蛋白基因的细菌表达质粒。转化宿主菌后用ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明ｐＺＰ３β融合蛋白在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达，并在蛋白印迹鉴定中能同兔抗猪ＺＰＩｇＧ呈特异性免疫反应。

绿色荧光蛋白与人肾脏NaDC3融合基因的构建及其在肾小管上皮细胞中的定位

本文采用RT-PCR方法从人的正常肾组织中扩增出hNaDC3基因全长cDNA序列,采用基因重组技术将hNaDC3基因和绿色荧光蛋白基因融合,通过真核表达质粒-脂质体介导,导入LLG-PK1细胞系,激光共聚焦显微镜动态观察GFP-hNaDC3的定位情况。结果显示pEGFP-C3空白质粒转染的LLC-PK1细胞表达了GFP,GFP在胞内分布以核浆为主,呈均匀致密的细颗粒荧光,胞核染色强,核仁荧光稀少,界线清楚。而pEGFP-C3-hNaDC3转染细胞株的绿色荧光蛋白,转染后第1天混合分布于细胞浆和细胞膜,以粗颗粒荧光为主,两者界限不清楚,胞浆中可见未染色的圆形空洞,未见胞核染色;第3天主要聚集于细胞膜,核周的胞浆中可见粗颗粒荧光物质,胞浆和胞膜界线清楚,胞核亦未见绿色荧光蛋白;第5天清晰聚集于细胞膜,细胞膜连接呈网状。因此hNaDC3蛋白在细胞质中生成后,定位于细胞膜并稳定表达。

人β-防御素3融合细菌膜穿透增加蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:探讨采用酵母表达系统进行人β-防御素3(hBD3)与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)融合表达的可行性.方法:将hBD3成熟肽基因通过Linker蛋白与BPI基因串联,克隆于酵母表达载体pPICZαB中,电转导入X-33毕赤酵母菌,经重组酵母基因组PCR和表型鉴定获得阳性克隆,对阳性克隆进行甲醇诱导表达,上清进行目的蛋白纯化和Western Blot鉴定.结果:重组载体经酶切和测序证实序列正确,重组X-33-pICZαB-hBD3-BPI克隆经甲醇诱导24h后,上清SDS-PAGE电泳显示有目的蛋白表达,Western Blot分析表明重组蛋白抗人hBD3和BPI均阳性,该目的蛋白依次通过疏水色谱、离子交换色谱纯化,蛋白纯度达到89%.结论:采用毕赤酵母系统融合表达hBD3和BPI是可行的.

IL-3-LDM融合蛋白对CD123^＋白血病细胞的靶向杀伤作用

目的:构建以IL-3为靶向、力达霉素(lidamycin,LDM)为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。方法:原核表达IL-3-LDP(interleukin 3-lidamycin)融合蛋白,组装活性烯二炔(active enediyne,AE)发色团得到IL-3-LDM。流式细胞术检测不同白血病细胞系(KG1-a、TF-1、M07e、HL-60、K562、Raji)表面CD123分子的表达,并检测融合蛋白IL-3-LDM与各白血病细胞的结合能力;CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白对不同CD123阳性率的白血病细胞的杀伤能力。结果:组装活性发色团得到的IL-3-LDM蛋白纯度可达90%以上。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)KG-1a细胞表面CD123阳性率最高(88.9%),其次为MO7e和TF-1细胞(>75%),再次为HL-60细胞(7.8%),而K562、Raji细胞CD123表达呈阴性。体外IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞(KG-1a、MO7e、TF-1和HL-60细胞)的结合能力和杀伤效率与细胞表面CD123的阳性率成正比,对于CD123表达率最高的KG-1a细胞,LDM的杀伤强度是多柔比星(adriamycin,ADR)的1 415.8倍,而IL-3-LDM的杀伤强度又是LDM的9.6倍。结论:IL-3-LDM融合蛋白可以有效携带细胞毒药物LDM并高效靶向杀伤CD123+白血病细胞。

重组融合蛋白大肠杆菌不对称合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸

将来自于Lactobacillus plantarum的突变D-乳酸脱氢酶(D-LDH^(Y52V))和Candida boidinii的甲酸脱氢酶(FDH)进行融合,重组成双功能融合蛋白,为生物法合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(D-PLA)提供新的方法。利用重叠延伸PCR技术,将对底物苯丙酮酸(PPA)亲合力更高的突变蛋白D-LDH^(Y52V)与FDH通过连接肽(Gly4Ser)3融合,将融合基因克隆至表达载体p ET-28a(+),并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导得到高效表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明,融合蛋白分子质量为79.7 k Da,在重组菌中获得了正确表达;酶活性测定结果表明,融合蛋白具有D-LDH和FDH的双重生物学活性。在不对称转化PPA合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(DPLA)的应用中,融合蛋白体系比D-LDH^(Y52V)单独表达体系的D-PLA产量提高了40.71%。通过5 h底物分批补加发酵,D-PLA产量为17.34 g/L,底物转化率为77.64%,生产强度3.47 g/(L·h)。双功能融合蛋白增强了辅酶再生的效率,有效促进了(R)-2-羟基-3-苯基丙酸的不对称合成。

应用禽呼肠孤病毒σ_3融合蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

将表达的禽呼肠孤病毒(ARV)σ3融合蛋白纯化后作为抗原,建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法,并对ELISA的反应条件进行了摸索,确定了抗原的最适包被浓度为3.98μg/mL,检测血清最适稀释倍数为1∶200,血清与抗原反应最佳反应时间为37℃作用2h,酶标二抗最佳作用时间为37℃作用1h,底物的最佳显色时间为25min。包被的抗原不与新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒等阳性血清发生交叉反应。用该方法建立的ELISA诊断方法,具有很好的敏感性和特异性,为ARV的诊断和检测以及血清学调查提供良好的技术手段。

猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白表达及活性检测

依据猫IFN-ω3和THY-α1的分子结构特征及大肠杆菌密码子的偏爱性设计引物,同时在IFN-ω3和THY-α1中间设计了1个(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)×3总共15肽的linker。采用搭桥PCR方法获得二者的融合基因。将该基因克隆至pBVIL载体中,构建了pBVIL-IFNω3-THYα1原核表达载体。将重组载体转化至Rosseta(DE3)细胞中,经过IPTG诱导表达及蛋白质分离纯化,获得了质量浓度为0.78 g/L的IFNω3-THYα1融合蛋白。经E玫瑰花环形成试验和细胞病变抑制试验,结果表明E玫瑰花环形成率平均为23.4%,融合蛋白的活力值为7.4%,细胞病变抑制试验同阳性对照组结果基本一致,融合蛋白中的IFNω3、THYα1均较好地保持各自的生物活性,为IFNω3-THYα1融合蛋白进一步的开发和应用奠定了基础。

人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础。方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-TEsay载体中并测序鉴定。将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,表达产物经Western blot鉴定,并通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的融合蛋白。结果:成功地构建了Id3的原核表达载体。Western blot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了His-Tag融合蛋白,亲和层析法纯化后获相对分子质量为34 000的Id3融合蛋白。结论:重组质粒pET32a(+)-Id3能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白。

含3C蛋白酶切位点的人CD226胞膜外区Ig融合蛋白的真核表达及应用

目的 :构建含 3C蛋白酶酶切位点的人CD2 2 6 (PTA1)分子胞膜外区Ig融合蛋白编码基因的真核表达载体 ,并进行表达和初步鉴定。方法 :将人CD2 2 6分子的胞膜外区基因 ,克隆入含 3C蛋白酶靶序列的Ig真核表达载体 p 3C Ig中。测序证实后 ,转染COS7细胞并进行瞬时表达。表达产物经亲和层析柱纯化 ,并通过免疫荧光染色及 3C蛋白酶酶切反应进行鉴定。结果 :经表达和纯化获得CD2 2 6胞膜外区的Ig融合蛋白。该融合蛋白可与表达于ECV30 4细胞表面的CD2 2 6配体有效结合。同时 ,融合蛋白的Fc段亦经 3C蛋白酶切除 ,从而获得CD2 2 6胞膜外区的真核表达分子。结论 :成功地获得了含有 3C蛋白酶酶切位点的人CD2 2 6分子胞膜外区Ig真核表达产物 ,为进一步对CD2 2 6分子进行结构和功能研究 。

MIP-3α-SA双功能融合蛋白的制备及其生物学功能鉴定

目的:制备链亲合素(SA)连接的MIP-3α融合蛋白MIP-3α-SA,并研究其生物学活性及功能。方法:构建MIP-3α-SA-pET21重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达MIP-3α-SA融合蛋白,经镍金属螯合(Ni-NTA)层析纯化,尿素梯度透析复性,聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、Western blot及银氨染色法鉴定融合蛋白;通过体外淋巴细胞趋化实验验证其趋化活性,流式细胞术分析其对已生物素化的小鼠前列腺癌RM-1细胞的表面锚定修饰效率。结果:MIP-3α-SA融合蛋白可在大肠杆菌Rosetta(DE3)中实现高效诱导表达,表达量占细菌总蛋白量的30%。经镍柱亲和层析纯化后该融合蛋白纯度达到95%。经尿素梯度复性后,验证该融合蛋白具有双重活性,即:MIP-3α介导的对人淋巴细胞的趋化作用且呈剂量依赖性,及SA介导的高效结合至表面已生物素化的小鼠前列腺癌RM-1细胞的功能(表面锚定修饰效率大于95%)。结论:MIP-3α-SA双功能融合蛋白具有双重活性,为MIP-3α表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制奠定基础。

抗人β防御素3融合蛋白抗体的制备及其活性检测

目的:人抗菌肽β防御素3(HBD3)除具有杀灭多种病原菌的作用外,还参与机体免疫防御的多个过程,本实验的目的是进一步了解HBD3在人体的生物功能。方法:通过将编码HBD3成熟链的基因与载体pGEX-KG相连,表达出谷胱甘肽S转移酶与HBD3(GST-HBD3)的融合蛋白,制备HBD3的抗体。结果:通过Western blot检测及免疫组化方法证实HBD3抗体的制备成功,显示了HBD3蛋白在食道上皮细胞的表达部位。结论:为进一步了解HBD3在人体的功能及其在疾病状态下的改变奠定了坚实的基础。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3融合蛋白的表达研究

利用PCR扩增得到粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)、白细胞介素 3(IL 3)完整基因片段 ,将其分别克隆至pGEM T ,构建成GM CSF/IL 3融合蛋白基因 ,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆至T7RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu ,经转化至表达宿主E .coliBL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS PAGE电泳鉴定扫描分析 ,目的基因产物表达量占菌体总蛋白量的 30 %以上 ,目的基因表达产物以包涵体的形式表达。Western blot鉴定表明 ,该表达产物可以与GM CSF抗体及IL 3抗体特异性结合。目的基因表达产物经过包涵体变性、透析复性及柱层析纯化 ,用GM CSF、IL 3依赖细胞株TF 1检测 。