人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-vⅢECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上。Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别。结论成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究。

肺腺癌中RNPC1蛋白、EGFRv Ⅲ蛋白表达水平及意义

目的探讨肺腺癌中RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白表达水平及意义。方法选取2015年1月至2018年4月我院保存的肺腺癌组织标本89例,同时选取癌旁组织作为对照组,采用Western blot检测RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白表达。结果肺腺癌组织RNPC1和EGFRvⅢ蛋白相对表达量分别为(0.833±0.122)和(0.910±0.115),明显高于癌旁组织(P<0.05);肺腺癌Ⅲ期、有淋巴结转移患者RNPC1蛋白相对表达量分别为(0.892±0.115)和(0.898±0.120),明显高于Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移患者(P<0.05);肺腺癌女性、中低分化患者EGFRvⅢ蛋白相对表达量分别为(0.960±0.139)和(0.933±0.112),明显高于男性、高分化患者(P<0.05)。结论肺腺癌中RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白表达明显升高,与临床病理特征有一定关系,值得进一步研究。

EGFRvⅢ胞外区基因重组腺病毒的构建及单域抗体的制备

本研究旨在构建能够表达人表皮生长因子EGFRvⅢ胞外区基因的重组腺病毒,并通过免疫骆驼构建噬菌体单域抗体库,筛选和制备EGFRvⅢ胞外区特异性单域抗体并对其进行鉴定。从人前列腺癌细胞系PC-3细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增EGFRvⅢ胞外区基因,并连接pAdTrack-CMV质粒载体,转化含有pAdEasy-1的大肠杆菌(Escherichia coli)BJ5183感受态细胞,获得同源重组质粒转染HEK293A细胞,得到表达EGFRvⅢ胞外区蛋白的重组腺病毒。利用重组腺病毒免疫双峰驼,构建EGFRvⅢ胞外区特异性噬菌体单域抗体库,并以EGFRvⅢ蛋白为筛选抗原,对其进行筛选,对筛选得到的单域抗体进行诱导表达、纯化及鉴定。结果表明获得了表达EGFRvⅢ胞外区基因的重组腺病毒。构建得到的EGFRvⅢ特异性噬菌体单域抗体库的库容为1.4×109;经过3轮富集和筛选,通过噬菌体ELISA筛选出31个与EGFRvⅢ胞外区蛋白结合的阳性克隆,并对OD450值较高的重组单域抗体E14进行了表达和纯化。经ELISA鉴定,重组单域抗体E14可与EGFRvⅢ胞外区蛋白产生抗原抗体结合反应,具有较高的亲和力。说明制备的EGFRvⅢ特异性噬菌体单域抗体库具有较高的库容和多样性,且筛选得到的单域抗体具有较高的抗原活性和免疫学反应性,为今后以EGFRvⅢ为靶点的恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的实验依据。

PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定

为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重组蛋白质纯化方法。首先构建重组表达质粒PD0721-pET-22b(+)并转化至大肠杆菌BL21中,再利用SDS-PAGE研究不同诱导剂IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间和不同菌体浓度对PD0721重组蛋白表达的影响。利用镍柱亲和层析开发PD0721重组蛋白的纯化方法,并使用蛋白质印迹法以及N端测序法对纯化后的蛋白质进行鉴定。菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳表明,PD0721-pET-22b(+)重组质粒及PD0721重组大肠杆菌BL21构建成功.PD0721重组蛋白在体外原核表达的最佳诱导剂浓度为0.6μmol/L,最佳温度为15℃,最佳诱导时间为12 h,最佳菌体浓度OD600约为0.6。经过Ni2+柱亲和层析后,当咪唑的浓度为150 mmol/L,可以得到纯度较高的PD0721重组蛋白。SDS-PAGE电泳和Western Blotting结果表明,重组蛋白质产物的相对分子质量约为31000,与理论相对分子质量一致,蛋白质的N端测序也与设计序列一致。作者成功构建了抗EGFRvⅢ抗体PD0721重组蛋白的体外原核表达体系,优化了最佳表达条件,并提供了纯化重组PD0721蛋白的可行方法。

探讨肺腺癌中RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白表达水平及意义

分析RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白表达水平在肺腺癌患者中表达的意义。方法:将牡丹江医学院近年来(2020.10-2021.10)期间收治的肺腺癌患者80例作为本次观察对象,分为观察组(患者癌组织)和对照组(癌旁组织),比较两组之间的表达情况(包括不同分期、不同性别、分化程度、淋巴结是否转移的RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白表达水平)。结果:观察组与对照组之间的RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白可见,观察组的相对更高(P<0.05),而所有患者不同分期的RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白分析可见,一期患者的RNPC1蛋白、EGFRvⅢ蛋白水平明显更低,三期患者明显更高(P<0.05);女性患者RNPC1蛋白与男性患者并无差异(P>0.05),EGFRvⅢ蛋白水平明显高于男性患者(P<0.05)。此外,女性患者中RNPC1蛋白和EGFRvⅢ蛋白的表达水平往往高于男性患者,提示癌细胞中可能存在一些性别差异,高分化患者的EGFRvⅢ蛋白可能显著升高(P<0.05),但RNPC1蛋白、与中低分化组并无明显差异(P>0.05)。结论:肺腺癌患者中RNPC1蛋白和EGFRvⅢ蛋白的表达水平均有不同程度的升高,这可能与临床病理特征有着一定的联系。

EGFRvⅢ与S100A9在人脑胶质瘤中的表达、相关性及其与预后的关系

目的：探讨表皮生长因子受体变异体Ⅲ（epidermal growth factor receptor variantⅢ，EGFRvⅢ）和S100钙结合蛋白A9（S100 calcium binding protein A9，S100A9）在人脑胶质瘤组织中的表达水平及其相关性，以及2种蛋白表达与胶质瘤预后的关系。方法：收集重庆医科大学第二附属医院2008年1月-2015年4月收治的110例经病理确诊的新发胶质瘤标本及其临床资料。同时，收集10例非肿瘤脑组织作为对照。采用免疫组织化学法检测胶质瘤标本和对照脑组织中EGFRyⅢ和S100A9蛋白的表达水平，运用Spearman等级相关分析法分析蛋白表达与胶质瘤患者临床病理因素的相关性。随访其中75例胶质瘤患者，实访67例，采用Kaplan—Meier法对随访资料进行生存分析。结果：低级别胶质瘤（Ⅰ～Ⅱ级）中EGFRvⅢ的中高表达率为20．00％，而高级别胶质瘤（Ⅲ～Ⅳ级）中EGFRvⅢ的中高表达率为38．00％，两者差异有统计学意义（P〈0．001）；低级别胶质瘤（Ⅰ～Ⅱ级）中$100A9的高表达率也明显低于高级别胶质瘤（Ⅲ～Ⅳ级）中S100A9的高表达率（11．67％vs66．00％，P〈0．001）。EGFRyⅢ和S100A9蛋白表达水平之间呈明显的正相关性（rs=0．785，P〈0．001）。Kaplan—Meier生存分析表明，EGFRvⅢ和S100A9蛋白均表达阳性的胶质瘤患者的预后较差（P=0.002）。结论：EGFRvⅢ和S100A9蛋白均随着胶质瘤恶性等级升高而表达增强。联合检测EGFRvⅢ和S100A9蛋白水平可以有效判断胶质瘤患者的恶性程度及预后，有助于为胶质瘤患者制定个体化的治疗方案。