不同给药方式下三氧化二砷对T细胞淋巴瘤EL4细胞体内及体外抑制作用

背景与目的:体外实验证明,三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)单药可抑制多种恶性淋巴瘤细胞的增殖,并呈时间依赖性和浓度依赖性。临床研究也提示,As2O3单药治疗多种病理亚型淋巴瘤有效。但目前As2O3的剂量、具体用法仍未确定。本实验研究不同给药方式As2O3对鼠源性T细胞淋巴瘤EL4细胞体内外的抗瘤作用,旨在了解As2O3不同给药方法对T细胞淋巴瘤疗效及不良反应。方法:MTT法检测8种浓度As2O3对EL4细胞的抑制作用,流式细胞仪分析、AnnexinⅤ-FITC/PI双标记检测细胞凋亡,电镜观察凋亡形态变化。建立EL4细胞裸鼠移植瘤模型,观察不同方案腹腔注射As2O3对EL4裸鼠移植瘤的抑制作用及裸鼠的耐受情况。结果:与对照组相比,不同浓度As2O3对EL4细胞均存在直接抑制作用(P<0.05),作用72h时的IC50为1.28μmol/L。体内实验显示,4mg·(kg·d)-1×7d与2mg·(kg·d)-1×14d给药对裸鼠移植瘤的抑制作用相近,抑瘤率分别为58.8%和55.6%(P=0.351)。移植瘤组织凋亡细胞增多并可见凋亡小体生成。毒性表现主要为急性肝损害的病理学变化。结论:As2O3体外可抑制EL4细胞增殖并可以诱导细胞凋亡,在总剂量相同的情况下,4mg·(kg·d)-1×7d与2mg·(kg·d)-1×14d的给药方式对裸鼠移植瘤生长的抑制作用近似。

表达红色荧光蛋白的小鼠淋巴瘤EL4细胞株的建立及鉴定

本研究通过慢病毒载体将红色荧光蛋白(DsRed)导入小鼠淋巴瘤EL4细胞,建立稳定高表达DsRed的EL4/DsRed细胞株,为建立携带红色荧光标记的小鼠肿瘤模型奠定基础。构建含新霉素耐药基因(neo)、内部核糖体进入位点序列(IRES)及DsRed的双顺反子自身失活型慢病毒载体。采用脂质体转染法将慢病毒三质粒包装系统共转染人胚肾细胞系293FT包装细胞,收集病毒上清,感染EL4细胞;利用G418的药物选择特性筛选感染细胞获得稳定表达DsRed的EL4细胞株,并扩大培养。结果表明:成功构建慢病毒表达质粒pXZ208-neo-IRES-DsRed,包装的重组慢病毒滴度可达106U/ml。病毒感染EL4细胞,经终浓度为600μg/ml的G418成功筛选出稳定携带DsRed的EL4/DsRed细胞株;荧光显微镜观察及流式细胞仪检测证实该细胞株长期稳定高表达DsRed。结论:通过表达DsRed的慢病毒载体感染EL4细胞,获得了稳定高表达DsRed的EL4/DsRed细胞株。

美法仑体内的抗肿瘤作用与IFN-γ的关系

目的:探讨单一剂量的美法仑对荷瘤野生型C57BL/6小鼠的疗效与IFNγ的关系。方法:以3种遗传背景相同、基因型不同的IFNγ+/+、IFNγ+/-和IFNγ-/-C57BL/6小鼠为模型,皮下接种数量相同的小鼠淋巴瘤EL4细胞。接种瘤细胞后12d,给基因型不同的各组荷瘤小鼠腹腔内单次注射7.5mg/kg的美法仑。以野生型C57BL/6荷瘤小鼠(IFNγ+/+)为对照,观察美法仑对IFNγ+/-C57BL/6荷瘤小鼠和IFNγ-/-C57BL/6荷瘤小鼠的治疗效应。结果:7.5mg/kg的美法仑单次腹腔内注射治疗后,可使IFNγ+/+和IFNγ+/-C57BL/6小鼠的肿瘤完全消退并治愈,而对IFNγ-/-荷瘤C57BL/6小鼠无治疗作用。结论:IFNγ与美法仑化疗的效果密切相关,即美法仑的抗肿瘤作用需要IFNγ参与。

CREG基因沉默诱导小鼠ESCs来源的EBs自发性凋亡

目的:探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)基因沉默诱导鼠源性胚胎干细胞(ESCs)来源的胚胎小体(EBs)自发性凋亡的作用。方法:应用pDS-shRNA-CREG逆转录病毒真核表达载体和绿色荧光蛋白(GFP)的对照载体,感染鼠源性胚胎干细胞R1,筛选获得稳定的细胞克隆(R1-shCREG和R1-GFP);用小鼠胚胎成纤维细胞株STO作为饲养细胞,进行R1、R1-shCREG和R1-GFP细胞培养。倒置显微镜观察3种ESCs的生长情况。碱性磷酸酶(AKP)染色和小鼠心肌接种畸胎瘤形成实验检测转染后ESCs分化情况。当ESCs生长至亚融合状态时进行传代,去除白血病抑制因子(LIF)并悬浮培养制备EBs。用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测3组EBs培养7 d时CREG和cleaved caspase-3蛋白和mRNA的表达,Annexin V/PI流式细胞术检测EBs细胞凋亡情况。结果:经pDS-shRNA-CREG逆转录病毒真核表达载体及GFP的质粒载体转染获得稳定转染的细胞克隆。AKP染色证实R1、R1-GFP和R1-shCREG 3组ESCs均保持未分化状态。同时,体内和体外分化研究证实,R1和R1-GFP组细胞具有三胚层分化能力,小鼠心肌内注射的ESCs形成畸胎瘤组织;而R1-shCREG则不能够形成畸胎瘤类似物,细胞分化能力降低,且细胞死亡现象增加。培养7 d的R1-shCREG/EB组CREG蛋白表达量较R1/EB组和R1-GFP/EB组均降低;CREG的mRNA表达下降;而cleaved caspase-3 mRNA和蛋白表达均显著升高;同时,R1-shCREG/EB细胞凋亡率明显升高。结论:下调CREG表达可抑制ESCs分化,促进ESCs来源的EBs细胞凋亡的发生。