重组蓖麻毒素A链的原核表达和单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的 实现重组蓖麻毒素A链（rRTA）的高效表达,获得rRTA的单克隆抗体,建立基于单抗的蓖麻毒素检测方法.方法 用计算机辅助设计的RNA二级结构预测和偏性密码子等手段设计引物 用PCR将rRTA基因克隆至载体pE132a（＋） 用双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定 IFTG诱导rRTA原核表达载体pET32a（＋）/rRA/BL21,用镍离子亲和层析纯化,ELISA及Western blot鉴定rRTA蛋白 rRTA免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株,获得抗rRTA的单克隆抗体,用Westem blot鉴定.结果 构建了rRTA原核表达载体pET32a（＋）/rRA/BL21,实现了rRTA在大肠杆菌BL21中的高效可溶性表达,获得了高纯度约10～20 mg/L rRTA 获得抗rRTA的单克隆抗体 建立的ricin EIJSA检测方法检出ricin的最低浓度为3.125 ng/mL,目视比色对蓖麻毒素的最低检出浓度为6.25 ng/mL.结论 本研究表达的rRTA及其单克隆抗体和基于单抗的ricin检测方法,将在肿瘤生物治疗、ricin生物恐怖袭击的侦检、治疗和预防中发挥重要作用.

仙台病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以纯化pQE31表达的融合蛋白仙台病毒FP(S)为诊断抗原、融合蛋白FP(S)免疫鼠血清为阳性抗体,建立了小鼠仙台病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法。该抗原FP(S)不与其他常见的小鼠病毒(小鼠肝炎病毒、鼠痘病毒、小鼠肺炎病毒和呼肠孤病毒Ⅲ型)的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于7%,与中国药品生物制品检定所的试剂盒符合率为98%。本研究建立的检测仙台病毒抗体的间接ELISA诊断方法,有很好的特异性和敏感性,为仙台病毒的抗体的检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

罗汉果茎尖脱毒技术研究

以罗汉果组培苗为试材,在高温热处理不同天数后剥取茎尖,进行罗汉果花叶病毒脱毒技术研究,同时采用间接ELISA法和电镜观察法检测其脱毒效果。结果表明:适合罗汉果热处理的时间为7～15d,试管苗的成活率可达90%～100%;38.5℃热处理10d剥取0.2～0.5mm的茎尖进行培养,脱毒率为100%。

重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA方法的建立

用纯化的H9N2亚型猪流感可溶重组NP蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流感抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为12.5μg/mL,37℃1 h,4℃过夜;血清稀释度为1∶40;酶标SPA稀释度为1∶10 000,37℃温育40 min,底物显色37℃15 min。经重复性试验、交叉试验、竞争抑制试验等试验,结果表明该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用TG-ROC软件确定了自制ELISA(NP-ELISA)酶标板的临界值为0.20,特异性和敏感性分别为95.83%和91.43%。与美国IDEXX试剂盒相比较,符合率为94.00%,无显著性差异。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份,总阳性率为35.40%。

人H-FABP单克隆抗体制备和纯化及其特性鉴定

目的制备人心肌型脂肪酸结合蛋白(Heart type fatty acid-binding protein;H-FABP)单克隆抗体。方法(1)应用淋巴细胞杂交瘤技术,将重组人H-FABP腹腔注射免疫BALB/C小鼠。(2)将鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合、培养。通过HAT和间接ELISA法筛选、鉴定制备稳定分泌抗人H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)利用Protein G Sepharose 4 Fast Flow亲合纯化体内诱生法制备的腹水抗体,并对抗体特性进行鉴定。结果得到7株特异性识别人H-FABP单克隆抗体,并纯化两株亲合力高、空间位点远的单克隆抗体。结论成功制备了稳定分泌抗人H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。